胡安康;朱孝荣;袁红花
【摘 要】Objective To establish a rat model of chronic renal failure in two ways and observe the leptin expression in the renal tissue of the rats. Methods 1. Chronic renal failure was induced by 5/6 nephrectomy ( Platt Method). 2.Rats were fed with 2.5％ adenine to cause chronic renal failure. The changes of blood BUN,Ca2+ , p5+ and Scr were assayed. HE and Masson staining were used for pathological examination,and immunofluorescence microscopy was used to observe the leptin expression in the renal tissue of the model rats. Results The changes of blood BUN,Ca2+ ,P5+ and Scr were significantly elevated in the rat models of chronic renal failure. Immunofluorescence displayed difference of the leptin expression in the renal tissues. Conclusions Two models of chronic renal failure are successfully established in rats to show the leptin expression in the renal tissues,providing a foundation for studies on the biologic significance of leptin protein.%目的 建立两种慢性肾衰竭大鼠模型,观察瘦素蛋白在大鼠组织、器官中的表达.方法 建立两种慢性肾衰竭CRF动物模型:(1)大鼠肾大部分切除诱发肾衰(Platt法).(2)腺嘌呤诱发大鼠慢性肾衰竭的动物模型(Yokozawa法).分别测定血清中血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr)Ca2+、P5+等含量.取肾脏组织,HE染,行免疫荧光,检测瘦素蛋白在两种慢性肾衰竭大鼠模型中的表达情况.结果 模型组大鼠血清中血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr)等含量明显升高,免疫荧光检测显示两种模型大鼠肾脏组织瘦素蛋白的表达.结论 成功建立两种慢性肾衰竭CRF动物模型,显示不同模型组织部位的瘦素蛋白的表达.为进一步探讨瘦素蛋白在动物体内的生物学作用提供实验基础. 【期刊名称】《中国实验动物学报》
【年(卷),期】2011(019)001
【总页数】6页(P34-38,后插4)
【关键词】慢性肾衰竭;瘦素蛋白;免疫荧光
高纯球形硅微粉【作 者】胡安康;朱孝荣;袁红花
龙脑抑菌剂【作者单位】徐州医学院实验动物中心,徐州,221002;徐州医学院实验动物中心,徐州,221002;徐州医学院神经生物学教研室,徐州,221002
【正文语种】中 文
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【中图分类】Q95-33;R692.5
瘦素(leptin)是主要由脂肪组织分泌的一种激素，由146个氨基酸组成。其前体为167个氨基酸的蛋白质，N-端21肽是信号肽。瘦素作为脂肪组织和中枢神经系统间网络联系的外周信号，可能通过血脑屏障作用于中枢神经系统，影响摄食行为和调整自主神经系统活动等，参与保持机体脂肪量恒定的自稳态调节机制。瘦素的生物学效应和其他激素一样，需要与特异性的受体结合才能发挥其生物学作用。瘦素受体基因(Lep-R)位于第4号染体db位点上，有一种全长型(b)，至少有5种不同的剪接形式(a、c、d、e、f)［1］。
研究表明肾脏是清除瘦素的主要器官，最直接的证据是大鼠双侧肾切除可导致血浆瘦素水平迅速增高［2］。瘦素的半衰期约为(9.4±3.0)min，正常大鼠静脉注射外源性瘦素后可迅速被代谢，随之尿中可检测到瘦素代谢产物［3］。但瘦素对于肾脏的其他影响还有待进一
步研究，我们拟建立简便、统一的CRF动物模型，观察瘦素蛋白在 CRF时的表达情况，为进一步深入阐释瘦素蛋白在慢性肾衰和尿毒症发病过程中的生物学作用奠定基础。
1.1 实验材料
手动皂液器1.1.1 实验动物：雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠30只，由徐州医学院实验动物中心提供【SCXK(苏)-2005-005】，体质量(200 ±30)g，随机分为三组，手术组(12)、腺嘌呤组(12)、对照组(6)。动物饲养在SPF级环境中【SYXK(苏)2007-038】。光照强度15 Lx，光照时间明暗各半。饲养室温度：(23±3)℃，湿度：50%。动物饲喂全价颗粒料，自由采食和饮水。
1.1.2 主要材料和试剂：腺嘌呤购自武汉博士德生物工程公司;瘦素抗体购自中山生物工程有限公司。
1.1.3 仪器：SW-CJ-1F型超净工作台(苏州安泰空气技术公司)，HR2140电子天平(Ohaus Corp.)，YXQ-SG41.280型电热手提蒸汽消毒器(上海医用核子仪器厂)，高速冷冻离心机、7221V可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，凝胶成像系统(Bio-Rad公司);电动匀浆器(Cole-Parmer公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠肾大部分切除诱发肾衰(Platt法)即手术组：先以(100 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，然后以乙醚诱导麻醉，使大鼠仰卧，下肢交叉固定于手术台上以暴露背部左肾区，从距左脊肋骨1.5 cm处做斜向外方切口，经后腹膜取肾，暴露肾脏，分离肾周脂肪后，弧形切除2/3肾组织(主要切除皮质部分)用明胶海棉压迫止血片刻，再滴加数滴纤维蛋白原和凝血酶溶液，稍等片刻，当切面上不再有活动性出血后复位剩余左肾，缝合。一周后切除整个右肾，两次手术共切除肾脏约80%左右。实验期间每隔15 d在大鼠尾静脉抽血，至30 d时腹腔静脉抽血，常规方法测定血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血钙(Ca)、血磷(P)、血甲状旁腺激素(PTH)。
1.2.2 腺嘌呤诱发大鼠慢性肾衰竭的动物模型(Yokozawa法)即腺嘌呤组：腺嘌呤1 g溶于40 mL生理盐水中制成混悬液，浓度为2.5%，按200 mg/(kg·d)剂量，每日定时给大鼠灌胃给药。自由摄取普通饲料、饮水。实验周期30 d，第29天晚禁食12 h，第30天晨采血5 mL，取2 mL血做红细胞计数(RBC)、血红蛋白定量(HGB)、红细胞体积(HCT)的测定。剩余血离心，分离血清测定 Ca2+、P5+、BUN、Scr含量。
1.2.3 组织提取、固定：两组模型分别处死迅速取一部分肾组织，4%甲醛(体积百分比)固定，石蜡包埋，切片、HE染，光镜病理组织学检查并摄片。
1.2.4 免疫荧光双标染：①取材：固定将预行免疫特异性染组大鼠肾脏固定于4%多聚甲醛液中12～24 h。②水洗、脱水、包埋。③石蜡切片。④切片脱蜡。⑤灭活内源性过氧化物酶。⑥微波修复。⑦羊血清封闭非特异性抗体。⑧结合一抗。⑨在暗室中加入Cy3标记的羊抗兔抗体(二抗)和FITC标记的羊抗鼠抗体(二抗)，4℃过夜(注意避光)。37℃复温 1 h。⑩0.01 mol/L PBS，每人 5 min×5。荧光封片剂封片。○11在共聚集显微镜下进行拍照。
pet铝膜2.1 模型组大鼠血常规检查和生化检查结果
与对照组大鼠比较，两种CRF大鼠模型已经制备成功，测定CRF比较有代表性的指标，如：血尿素氮(BUN)，血肌酐(Scr)等明显升高(表1和表2)。
2.2 肾脏组织HE染结果
正常对照组肾脏大小正常、颜暗红，组织学未见显著改变。腺嘌呤组损伤最重，手术组
损伤较轻，两组模型组大鼠肾体积明显增大，个别大鼠肾体积较正常对照组增大1倍以上，颜苍白。HE染见局灶性间质纤维化，伴大量淋巴和单核细胞的浸润，部分肾单位萎缩，肾小管呈囊性扩张，上皮萎缩。(见图1，彩插4)
2.3 肾脏组织中瘦素蛋白的免疫荧光结果
与对照组大鼠比较，荧光显微镜下显示模型组大鼠肾脏细胞内有绿荧光，显示荧光存在细胞质内，表明大鼠肾脏细胞内有瘦素蛋白的表达(见图2，彩插 4)。
3.1 慢性肾衰竭大鼠模型建立的探讨与思路
lncrna引物设计慢性肾衰竭是多种慢性肾脏疾病的最终归宿。在慢性肾衰竭的发病过程中，肾间质纤维化和肾小球硬化几乎是各种肾脏疾病进展到终末期的共同途径和主要病理改变基础。建立符合人类多种慢性肾脏疾病中后期病理改变的动物模型，是研究如何对肾间质纤维化和肾小球硬化进行预防、及抗CRF的病程进展的重要途径［4］。
现在常用造模方法大致可分为以下几类：①腺嘌呤肾毒性模型［5］：用含0.75%腺嘌呤饲料喂养大鼠，每日投入量约350 mg/kg，2周后血肌酐，尿素氮水平开始升高。此法方法简
便，肾衰现象明显，成功率相对偏高。不过实验中也发现导致采食不一而使模型产生较大差异，动物死亡率较高。②阿霉素动物模型［6］：大鼠尾静脉注射阿霉素 2～3 mg/kg，每周1次，连续用药3～4次，可诱发典型的肾小管硬化和CRF。阿霉素动物模型比较稳定，但该模型大鼠在用药20周后肾小球细胞凋亡才明显增加，延长了实验周期。③慢性血清病动物模型［8］：给家兔每天注射牛血清白蛋白10～15 mg/d，连续1～6个月后家兔即出现肾病综合征和氮质血症。该模型制作最大缺点是动物个体差异大，死亡率高。④自发性CRF动物模型［7］：动物随年龄增长和衰老，肾小球逐渐发生退行性变。这种模型动物常伴有多种机能退化，影响疗效观察。⑤用物理方法减少或破坏肾组织：运用肾切除等物理方法造成大量肾组织破坏，残余肾单位的功能代偿性增强，引起残余肾单位的高滤过蛋白尿，导致肾小球硬化为主要特点的CRF。
腺嘌呤诱发大鼠慢性肾衰竭的动物模型(Yokozawa法)形成机制是利用肾毒物的肾脏损害原理，导致氮质血症，毒素蓄积及电解质和氨基酸代谢紊乱，最终引起肾衰竭。此法方法简便，肾衰现象明显，有重要的科研价值，适用评价急性肾衰抢救阶段的用药和手段。
大鼠肾大部分切除诱发肾衰(Platt法)模型形成机制是由于手术切除部分正常肾组织，残肾
超负荷工作成肾组织肾小球高灌注、高滤过、高压力及其通透性改变和肾小管高代谢等病理状态，符合肾小球高滤过致肾衰竭学说，排除了各种原发性和继发性致病因素本身对残余肾单位的影响，使影响因素简单化，便于研究在大部分肾组织丧失的情况下，“正常”残存肾单位所发生的一系列改变及其机理。在评价具有减轻肾组织高灌流、高滤过及抑制系膜细胞增殖和抗氧化作用的新药时，此模型更为适用［9］。
从本实验结果可以看出两种不同方法的肾衰模型各有优点和缺点，可分别适用不同领域的研究。大鼠肾大部分切除诱发肾衰(Platt法)模型可能更倾向于临床多发高发的肾衰疾病的结果。符合人类多种慢性肾脏疾病导致功能衰竭的中后期功能和病理形态改变。
3.2 两种CRF模型瘦素水平
动物实验及临床研究均表明肾脏是清除瘦素的重要器官，瘦素经过肾小球滤过后在肾小管重吸收并被降解。
大鼠双侧肾切除可导致血浆瘦素水平迅速增高，瘦素水平的升高，肾脏对瘦素清除增加，没有出现饱和现象，提示肾脏清除瘦素是一个高效不会饱和的过程，最可能是通过肾小球滤过［10，11，12］
肾脏是循环血中瘦素清除的主要部位［14］。对大鼠及人类的研究表明，瘦素是以原型形式从肾小球滤过，由肾小管上皮细胞摄取并代谢降解，降解产物从尿中排出［13，15］。慢性肾衰竭患者，肾小球或(和)肾小管受损，HE染片清晰反映肾小管上皮细胞受损严重，肾小球部分萎缩，肾脏清除瘦素的能力下降，致使瘦素在体内积聚，免疫荧光片反映瘦素蛋白在CRF时，由于肾小球滤过能力降低，大量瘦素蛋白在肾脏中蓄积，这是慢性肾衰竭普遍存在高瘦素血症的主要原因之一。另外慢性肾衰竭患者存在促进瘦素生成的各种因素如炎症、脂肪积累、高胰岛素血症、高皮质醇等，这些因素也造成体内瘦素增多。慢性肾衰竭患者瘦素水平的高低与正常人一样仍与体内脂肪含量密切相关［16，17］。本课题中肾脏组织免疫组化瘦素表达结果，肾衰后增高，这与肾衰高瘦素血症有关。
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