·基础研究·
上皮屏障功能损伤
梁珊珊1魏丽敏2魏萌2刘华2孙凌霜2陈蕾2高凡凡2蒋红利2
【摘要】目的探讨肠源性尿毒症毒素同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对腺嘌呤诱导的尿毒症大
鼠肠道屏障结构功能的影响。方法SD大鼠分为对照组(NC组,n=10)、Hcy组(H组,n=10)、尿毒症(U组,
n=10)、尿毒症+Hcy(UH组,n=10)和尿毒症+Hcy+益生菌(VSL#3,Sigma-Tau公司，美国)(UHV组,n=10)。腺
嘌呤灌胃及皮下注射Hcy造模，检测肾功能及病理组织染评估动物模型。HE染及透射电镜观察肠道
组织结构病理变化。检测血和肠组织Hcy、白细胞介素-6(interleukin,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tu-
mor necrosis factor,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialde- hyde,MDA)水平、内毒素和肠道通透性。Western blotting法检测紧密连接(tight junction，TJ)蛋白 claudin-1、occludin和ZO-1水平。结果与NC组相比，各组血清和肠组织匀浆中Hcy(血清F=153.666,
P＜0.001；肠组织F=44.456,P＜0.001)、IL-6(血清F=86.845,P＜0.001；肠组织F=89.946，P＜0.001)、
TNF-α(血清F=29.782，肠组织F=23.629，P＜0.001)、MDA(血清F=52.367,P＜0.001；肠组织F=58.976，
P＜0.001)、血清内毒素水平(F=37.287,P＜0.001)和肠通透性(F=50.539，P＜0.001)显著增高，SOD活性
降低(血清F=106.538,P＜0.001；肠组织F=114.599，P＜0.001)，以UH组为著；UH组肠道病理损伤最严
重，各组TJ蛋白水平不同程度降低。补充益生菌VSL#3可不同程度上改善氧化炎症损伤并上调TJ蛋白 表达丰度。结论Hcy通过诱导氧化炎症损伤，加重肠通透性增加和上皮屏障破坏。复合益生菌VSL#3
可通过降低Hcy诱导的氧化炎症水平改善此损伤。
【关键词】同型半胱氨酸；尿毒症；肠上皮屏障；氧化炎症；益生菌
中图分类号：R365文献标识码：A doi:10.3969/j.issn.1671-4091.2021.05.009
Homocysteine aggravates intestinal epithelial barrier dysfunction in rats with experimental uremia
LIANG Shan-shan1,WEI Li-min2,WEI Meng2,LIU Hua2,SUN Ling-shuang2,CHEN Lei2,GAO Fan-fan2,JI-
ANG Hong-li21Department of Blood Transfusion and2Department of Blood Purification,The First Affiliated
Hospital of Xi’an Jiao Tong University,Xi’an710061,China
Corresponding author:JIANG Hong-li,Email:***************
【Abstract】Aims To investigate the effect of intestinal-derived uremic toxin homocysteine(Hcy)on in-
testinal permeability,barrier structure and barrier function in adeninEinduced uremic rats.Methods SD rats
were divided into five groups:normal control(group NC,n=10),Hcy(group H,n=10),uremia(group U,n=
10),uremia+Hcy(group UH,n=10),and uremia+Hcy+probiotic compound preparation VSL#3(group UHV,
电动开瓶器
n=10).Experimental uremia was induced by intragastric adenine administration and Hcy was injected subcuta-
neously.Animal models were assessed by renal function and pathological examinations.The pathological
changes of intestinal tissue were observed by H-E staining and electron microscopy.The levels of Hcy,inter-
leukin(IL-6),tumor necrosis factorα(TNF-α),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in
serum and intestinal tissue,serum endotoxin,and intestinal permeability were assessed.The tight junction pro-
teins of claudin-1,occludin,and ZO-1were assessed by western blotting.Results Compared with group NC,
serum and intestinal tissue levels of Hcy(serum:F=153.666,P＜0.001;tissue:F=44.456,P＜0.001),IL-6(se-
rum:F=86.845,P＜0.001;tissue:F=89.946,P＜0.001),TNF-α(serum:F=29.782,P＜0.001;tissue:
F=23.629,P＜0.001),and MDA(serum:F=52.367,P<0.001;tissue:F=58.976,P＜0.001),serum endotoxin
(F=37.287,P＜0.001),and intestinal permeability(F=50.539,P＜0.001)were significantly elevated,while se-
rum and tissue SOD activity decreased(serum:F=106.538,P＜0.001;tissue:F=114.599,P＜0.001)in the ex-
perimental groups,especially in UH group.The most pathological changes of intestinal structure were also
基金项目：陕西省重点研发计划一般项目(2020SF-122)；西安交通大学第一附属医院青年基金(2019QN-27)
作者单位：710061西安，西安交通大学第一附属医院1输血科2血液净化科
通讯作者：蒋红利710061西安，西安交通大学第一附属医院2血液净化科Email：***************
found in group UH.The levels of tight junction proteins decreased in the experimental groups.Supplementa-tion with probiotic compound preparation VSL#3improved oxidative and inflammatory injuries and the ex-pression levels of tight junction proteins.Conclusion Hcy aggravates the damages of intestinal permeability and epithelial barrier by induction of oxidative and inflammatory injuries in uremic rats.Probiotic administra-tion ameliorates these damages by reduction of Hcy-induced oxidative and inflammatory injuries.芯片生产
【Key words】Homocysteine;Uremia;Intestinal epithelial barrier;Oxidative and inflammation;Probiotics
高同型半胱氨酸(hyperhomocysteine,HHcy)是多种疾病的危险因素[1,2]。尿毒症状态下，肠道通透性增大，体内蓄积的毒素物质对肠上皮屏障结构造成直接损伤；肠道菌紊乱，益生菌减少，肠道微生态失衡，肠腔内毒害物质通过受损的肠上皮屏障进入血液循环，引起或加重机体全身性炎症反应、氧化应激等并发症，形成恶性循坏。紧密连接(tight junc-tion，TJ)是肠黏膜机械屏障的主要结构，也是最常受损的结构。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)作为重要的肠源性尿毒症毒素[3]，其对肠上皮结构功能的影响尚不明确。
本研究拟基于腺嘌呤灌胃的尿毒症大鼠模型，给予低剂量Hcy持续皮下注射，建立尿毒症HHcy模型，继而检测模型动物肠道通透性、氧化炎症因子水平、肠道组织病理结构及肠上皮屏障TJ结构改变，探究Hcy是否参与尿毒症肠道损伤；并采用益生菌(VSL#3,Sigma-Tau公司，美国)干预，进一步观察Hcy 水平、氧化炎症因子水平和TJ蛋白变化，为探讨尿毒症肠道改变的病理生理机制及以肠道为靶点降低毒素提供新思路。
1材料与方法
1.1动物模型制备及分组
SPF级SD大鼠65只，自由饮水摄食，适应性饲养1w无异常后造模。本研究经西安交通大学第一附属医院动物研究委员会批准(2015伦审科字第86号)。大鼠随机分组造模，分为NC组(n=10，每日生理盐
水灌胃+皮下注射生理盐水)；H组[n=10，每日生理盐水灌胃+皮下注射Hcy0.06mol/(g•d)，30d]；U组[n=10，腺嘌呤灌胃250mg/(g•d)灌胃，前14d持续，后14d隔日]；UH组[n=10，U组模型基础上+皮下注射Hcy0.06mol/(g•d)，30d]；UHV组[n=10，U组基础上+皮下注射Hcy0.06mol/(g•d)+VSL#3灌胃，30d]。定期观察记录5组大鼠体质量、饮食、毛及活动状态。
1.2肠道通透性检测
永磁电机设计5组随机选5只测肠道通透性。提前禁食8h，自由饮水，分别给予含5μCi/ml锝99标记的二乙烯三胺五乙酸(99mTc-DTPA)溶液1ml灌胃，单独放入代谢笼，收集24h尿液并定量，测24h尿99mTc-DTPA浓度。尾静脉采血500µl，测血中残留核素浓度。通过估算大鼠血容量[血容量ml=(0.06×体质量g)+ 0.77]换算体内残留核素量。用γ射线计数器检测血、尿放射性水平。肠道通透性以24h尿液所含99mTc-DTPA总量及血中残留核素量之和占灌胃99mTc-DTPA量的百分比表示。肠道通透性计算公式：
1.3Hcy及氧化炎症因子检测
大鼠麻醉后腹主动脉采血分离血清，检测肾功能和炎症因子。留取肾脏和末端回肠样本进行预处理。委托西安交通大学第一附属医院检验科检测肾功能；酶循环法(迈克，四川)测Hcy；ELISA法测白细胞介素-6(interleukin,IL-6)(R&D，美国)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)(酶研生物科技有限公司，上海)水平；硫代酸缩合法测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和黄嘌呤氧化酶法测超氧
化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)(建成公司，南京)。
1.4回肠组织病理改变和超微结构观察
HE染：脱水、透明、包埋，石蜡切片，染观察。电镜：生理盐水漂洗切取回肠组织，3%冷戊二醛溶液固定，取出后1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，环氧丙烷置换，Epon-812树脂包埋、切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重电子染，透射电镜观察。
1.5Western Blotting检测肠上皮TJ蛋白表达
提取回肠组织总蛋白，牛血清白蛋白试剂盒(Pierce公司，美国)测蛋白浓度，加样40μg/孔，10%SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉37℃摇床封闭2h；孵育一抗anti-claudin-1(1:1000，Abcam)；anti-occludin(1:500，Abcam)；anti-ZO-1(1:1000，Thermo Fisher)，anti-β-actin(1:1000，CWbio) 4℃过夜，洗膜，室温孵育二抗(1:5000，Boster)，洗膜，化学发光HRP试剂盒微孔(millipore,MA)显。增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)系统(Pierce公司，美国)进行检测，NIH图像
血容量×剂量/500µl+尿量×剂量/500µl
给予的总剂量
×100%肠道通透性=
软件扫描，结果用目的蛋白条带面积灰度值与β-actin条带面积灰度值比值表示。
1.6统计学方法
所有数据经SPSS18.0软件处理。对参数分布样本，结果以均值±标准差(x±s)表示，2样本均数之间采用独立样本t检验，多组样本均数之间采用ANOVA方差分析，多组内样本两两之间差异采用LSD-t检验，P＜0.05为有统计学差异。
2结果
2.1大鼠模型的建立和评估
U组大鼠早期出现多尿多饮，精神萎靡，摄食减少，体质量下降、毛发干枯，唇苍白，目淡红，耳廓湿冷，性情淡漠、活动减少等。UH组表现同U组。
与NC组相比，其余各组体质量增长缓慢(F= 7.849，P＜0.001)，血肌酐(F=248.331，P＜0.001)、尿
素氮(F=42.933，P＜0.001)明显增高，达到尿毒症模型标准；与UH组相比，UHV组大鼠体质量有所改善(t=-2.265，P=0.036)，肌酐(t=0.302，P=0.766)、尿素氮(t=0.288，P=0.777)无明显改善。与NC组相比，各组血清和肠组织中Hcy(血清F=153.666, P＜0.001；肠组织F=44.456,P＜0.001)；UHV组Hcy 水平较UH组有所下降(血t=-1.807，P=0.029；肠t=-1.733，P=0.032)，见表1。组织病理染可见NC 组肾脏结构未见明显异常。Hcy组肾小球完整性和肾间质基本无明显改变。其余3组均发生改变明显改变，肾小球结构紊乱、系膜增生、肾小管广泛扩张、上皮细胞脱落，间质胶原纤维增生呈束状或网片状，炎细胞浸润，以UH组为著，见图1。
2.2肠上皮组织病理学改变和电镜超微结构改变
HE染可见NC组回肠组织结构大致正常。Hcy 组肠绒毛有轻微松动，粘膜下层轻度分层。U组肠绒毛断裂、排列松散，粘膜下分离，浸润性炎细胞向肠绒毛两侧延伸。UH组损伤严重，肠绒毛稀疏断裂、甚至脱落，粘膜下分层严重，大量炎细胞浸润。电镜观察超微结构可见NC组肠微绒毛排列整齐紧密，肠上皮细胞间TJ结构清晰完整。Hcy组肠微绒毛排列基本整齐，轻度变细，TJ结构基本完整。U组肠微绒毛排列稀疏不规则，绒毛变细变短、边缘不光滑、局部出现破裂，上皮细胞间TJ构变细，电子密度降低、完整性破坏，粘膜下明显水肿和胶原纤维增生。UH组肠粘膜下出现严重水肿和大量胶原纤维沉积，肠微绒毛缝隙宽大，绒毛变细变少断裂，TJ变细，电子密度降低、颜变浅模糊，连续性破坏。UHV组可见肠粘膜损伤有改善，黏膜下分层及绒毛断裂和破坏减少；TJ结构电子密度增大，粘
膜及粘膜下损伤减轻，微绒毛变多增粗、缝隙变窄，胶原纤维沉积减少，见图1。
2.3Hcy对肠上皮通透性、TJ结构影响及益生菌干预的作用
与NC组相比，各组血清内毒素水平(F=37.287, P＜0.001)和肠道通透性(F=50.539，P＜0.001)显著增高；与UH组相比，UHV组血清内毒素水平(t=1.534，P=0.043)和肠通透性(t=1.231，P=0.041)有所改善。与NC组相比，各组TJ蛋白表达呈降低趋势(F值分别为F=58.799，10.866，36.477；P值均为＜0.001，以UH组显著降低；与UH组相比，UHV组TJ蛋白和ZO-1表达水平有改善(t值分别为-1.763，-6.964，-3.249；P 值分别为0.044，0.018，0.031)(图2)。
2.4血清及回肠组织中氧化炎症因子检测
各组血清和回肠组织匀浆中氧化炎症检测结果显示，与NC组相比，IL-6(血清F=86.845,P＜0.001；肠组织F=89.946，P＜0.001)、TNF-α(血清F=29.782, P＜0.001；肠组织F=23.629，P＜0.001)、MDA(血清F=52.367,P＜0.001；肠组织F=58.976，P＜0.001)含量增高、SOD活性降低(血清F=106.538,P＜0.001；肠组织F=114.599，P＜0.001)；与UH组相比，UHV组血清和肠组织中IL-6(血清t=1.641，P=0.039；肠组织t=2.447，=0.042)、TNF-α(血清t=-1.741，P=0.008；肠组织t=2.195，P=0.046)、MDA(血清t=-1.959，P=0.041；肠组织t=-1.878，P=0.043)水平有所下降，SOD活力轻度增高(血清t=-2.162，P=0.042；肠组织t=-2.644，P=0.045)，见表2。
3讨论
本研究主要探讨Hcy对尿毒症大鼠肠上皮结构和功能的影响。结果显示Hcy可能通过氧化炎症损
表15组大鼠体质量、血肌酐、尿素氮、血Hcy及肠组织Hcy比较(x±s)组别体质量(g)血肌酐(μmol/L)血尿素氮(mmol/L)血Hcy(μmol/L)肠Hcy(μmol/L)
NC组(n=10)292.50±59.3322.20±5.499.03±3.82 6.94±2.74 1.13±0.28
H组(n=10)269.50±42.0426.00±9.3110.13±3.368.54±2.83 1.40±0.29
U组(n=10)215.30±34.69195.50±22.1949.63±10.6920.20±5.98 2.27±0.37
UH组(n=10)217.40±31.73206.90±22.6453.23±16.4331.24±3.89 3.08±0.35
UHV组(n=10)232.00±36.47212.80±29.3951.27±13.9326.30±5.27 2.62±0.41
F值7.849248.33142.93360.90956.148
P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001
注：Hcy：同型半胱氨酸;NC：正常对照；H：同型半胱氨酸；U：尿毒症；UH：尿毒症+同型半胱氨酸；UHV：尿毒症+同型半胱氨酸+益生菌VSL#3
伤促进尿毒症大鼠肠上皮通透性增加和TJ 结构损伤；补充益生菌可降低Hcy水平，减轻高Hcy引起的损伤，从而改善尿毒症肠上皮屏障功能。
Hcy 是内源性代谢和肠道细菌代谢的肠源性毒素[1]。ESRD 患者血浆Hcy 明显升高，但高Hcy 在尿毒症肠上皮损伤中的作用仍不清楚。本研究结果显示与U 组相比，UH 组Hcy 明显升高，肠道损伤更严重，TJ 蛋白表达减少与UH组内毒素水平和肠通透性增加呈正相关，表明Hcy在尿毒症时更易蓄积。ESRD时慢性局部和全身炎症可导致肠道细菌易位、菌失调、毒性代谢物蓄积以及肠上皮损伤[2-4]。Hcy 能诱导产生活性氧引起氧化损伤、上调TNF-α、IL-6等促炎因子表达[5,6]。本研究发现UH 组Hcy 浓度、氧化炎症水平
远高于U组，提示Hcy浓度与氧化炎症水平、肠道通透性和肠上皮紧连接损伤程度呈正相关。Hcy 可通过诱导尿毒症氧化炎症水平，促进尿毒症时肠上皮屏障结构功能损伤。
益生菌调节肠道菌，改善肠上皮细胞结构和功能[7,8]。某些共生菌和益生菌可产生维生素B、维生素K、叶酸等直接参与肠道能量代谢[9]。VSL#3是由嗜热链球菌、4种乳酸菌和3种双歧杆菌组成的合剂，含菌量高、种类多，不同菌株功能之间作用独特又协同。本研究中，VSL#3灌胃30天后，UHV组大鼠状态明显改善，Hcy 及氧化炎症水平降低，肠通透性降低，TJ 蛋白丰度增高。表明益生菌可通过调节肠道菌，促进肠道细菌产生维生素B、叶酸等物质参与Hcy代谢，
注：VSL#3：益生菌复合制剂；(A)肾脏HE 染(×200)；(B)肾脏Masson 染(×200)(细箭头示肾小球；宽箭头示肾间质；小三角示胶原纤
维组织)(C)回肠组织HE染(×200倍，黑细箭头示肠绒毛)；(D)回肠组织超微结构(细箭头示紧密连接；短粗箭头示肠绒毛；三角形指示炎性水肿和胶原纤维增生，标尺=1μm)
图1
肾脏组织病理改变情况及肠上皮组织病理学和电镜超微结构改变
表2
5组大鼠血清和回肠组织匀浆中氧化炎症因子水平(x ±s )
组别
血清
肠组织匀浆管式热交换器原理图
IL-6TNF-αMDA SOD IL-6TNF-αMDA SOD (μmol/L)(μmol/L)(nmol/mg)(U/mg prot)(μmol/L)(μmol/L)(nmol/mg)(U/mg prot)
N 组(n =10)114.48±19.9795.39±19.08 1.79±0.34206.56±24.5964.53±20.7771.39±21.83 1.34±0.23169.26±20.65H 组(n =10)144.20±21.38122.18±27.28 2.54±0.78180.21±22.4886.40±19.1593.99±14.00 1.79±0.46149.79±21.64U 组(n =10)227.92±24.32151.83±21.22 3.41±0.85143.64±28.68113.52±25.74118.33±19.09 2.30±0.40130.84±23.00UH 组(n =10)303.52±41.44203.37±36.95 4.40±1.0996.15±23.67157.22±30.22152.27±27.93 3.03±0.5699.35±12.96UHV 组(n =10)272.57±42.89177.58±37.24 3.57±0.78121.77±29.06131.31±14.40127.79±21.54 2.63±0.39119.37±20.13F 值86.84529.78252.367106.53889.94623.62958.976114.599P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001注：NC：正常对照；H：同型半胱氨酸；U：尿毒症；UH：尿毒症+同型半胱氨酸；UHV：尿毒症+同型半胱氨酸+益生菌VSL#3；IL-6：白细胞介素-6；
TNF-α：肿瘤坏死因子-α；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛
97xoo
降低Hcy 水平，减轻Hcy 蓄积诱导的肠上皮氧化炎症损伤。
综上所述，本研究初步证实Hcy 可通过诱导氧化炎症反应而加重尿毒症时肠通透性增加和TJ 结构损伤。补充VSL#3益生菌可通过调节肠道菌，参与Hcy 代谢，改善尿毒症肠道损伤。本研究对我们进一步认识Hcy 对肠上皮毒性及以肠道为靶点降低毒素水平，改善尿毒症相关并发症具有重要意义。
作者贡献：梁珊珊：研究开展及数据收集分析、论文撰写；魏丽敏、魏萌、高凡凡：动物实验、炎症因子检测；魏萌、孙凌霜、刘华：肠道通透性检测；刘华、孙凌霜、陈蕾：HE 染、电镜实验；梁珊珊、高凡凡：Western blotting实验；魏丽敏、陈蕾：数据分析及图片整理；蒋红利：实验设计、开展及论文撰写。
利益冲突声明：本文作者不涉及任何相关利益冲突问题。
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(收稿日期：2020-12-01)
(本文编辑：苏华)
注：NC：正常对照；H：同型半胱氨酸；U：尿毒症；UH：尿毒症+Hcy；UHV：尿毒症+同型半胱氨酸+益生菌VSL#3；A：内毒素；B：肠道通透性;C：West-ern blotting 检测紧密连接分子Claudin-1、Occludin 和ZO-1的蛋白印迹表达；D、E、F 灰度分析结果：1)
：
各组与NC 组相比，Claudin-1、Oc-cludin和ZO-1的F 值分别为58.799，10.866，36.477；P 值分别为＜0.001，＜0.001，＜0.001；2)：UH组Claudin-1、Occludin和ZO-1与U组比较
t 值分别为6.528，43.873，7.358；P 值分别为0.003，＜0.001，0.005；3)
：UHV 组Claudin-1、Occludin 和ZO-1与UH 组比较t 值分别为-1.763，-6.964，-3.249；P 值分别为0.044，0.018，0.031
图2各组大鼠内毒素、
肠道通透性及回肠组织紧密连接蛋白表达水平
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