去内毒素质粒提取用结合液及试剂盒及质粒提取方法与流程

1.本发明涉及质粒提取领域，尤其是涉及一种去内毒素质粒提取用结合液及试剂盒及质粒提取方法。

背景技术：

2.质粒是染体外的能独立遗传的共价闭合双链dna分子，它存在于细菌和其它一些生物体内，能够提供给宿主细胞一些表型如抗药性，分解复杂有机物的能力。野生质粒经过改造后可以作为基因工程的载体，这种质粒载体在基因工程中具有极广泛的应用价值。因此质粒的分离与提取是分子生物学最常用、最基本的实验技术之一。
3.细菌质粒是最常用的基因工程载体，通过hipure plasmid kits试剂盒提取的质粒可直接用于自动测序、酶切、pcr和标记等。但在我们提取质粒过程中容易受到各种污染，其中最难解决的就是内毒素。
4.内毒素也称为脂多糖或lps，是革兰氏阴性(如大肠杆菌，e.coli)胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个e.coli包含约2百万个lps分子，每个lps分子又由疏水性的脂质a、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。
5.内毒素分子的化学结构、特性及其倾向于形成微团结构的特点，使其常与质粒dna共存从而被共同纯化出来。
6.内毒素会对原代细胞的dna转染产生严重影响，同样也会影响对培养细胞的敏感性，内毒素水平增加可导致转染效率的大幅下降。进而，使用无内毒素的质粒dna对于基因方面的应用尤为重要，因为内毒素会导致发热、内毒素休克并会在动物和人体中激活补体级联反应。内毒素也会对体外转染免疫细胞如巨噬细胞和b细胞造成干扰，因为其可非特异性的诱发免疫反应。反应包括合成免疫递质如il-1和前列腺素。为了防止对实验结果造成误判，实验中务必使用无内毒素污染的塑料制品、培养基、血清以及质粒dna。
7.去除内毒素的常规方法有液相分离法，利用一些去污剂，如triton x-114(曲拉通x-114)，脱氧胆酸钠能够和内毒素的脂质部分结合，通过液相分离的方法萃取内毒素，得到没有内毒素的上清液，再将上清液过柱吸附来进一步纯化质粒。
8.但是，通过萃取的方法去除内毒素时，萃取速度较慢，且容易出现分层不明显的现象，导致整个过程周期较长，提取质粒效率较低的且去内毒素效果一般，因此还有改善空间。

技术实现要素：

9.为了提高提取质粒的效率并且提高去内毒素的效果，本技术提供一种去内毒素质粒提取用结合液及试剂盒及质粒提取方法。
10.第一方面，本技术提供一种去内毒素质粒提取用结合液，采用如下的技术方案：
11.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114，所述异硫氰酸胍在结合液中的摩尔浓度为2-5mol/l，所述曲拉通x-114在结合液中的体积百分比为1-5％(v/v)。
12.优选的，所述异硫氰酸胍在结合液中的摩尔浓度为3-4mol/l，所述曲拉通x-114在结合液中的体积百分比为2-4％(v/v)。
13.优选的，所述异硫氰酸胍在结合液中的摩尔浓度可以为2-3mol/l、3-3.5mol/l、3.5-4mol/l、4-5mol/l，所述曲拉通x-114在结合液中的体积百分比可以为1-2％(v/v)、2-3％(v/v)、3-4％(v/v)、4-5％(v/v)。
14.通过采用上述技术方案，通过曲拉通-114和异硫氰酸胍在特定的浓度范围内复配，曲拉通-114和异硫氰酸胍能进行偶联，通过在提取质粒的过程中加入结合液，即可实现内毒素去除，减免了现有技术中先萃取再过柱的步骤，使得质粒提取可以更加高效快速，且不存在分层不明显的问题，去除内毒素的效果较佳且较为稳定。
15.而且，通过曲拉通-114和异硫氰酸胍在特定的浓度范围内复配，还能够在去除内毒素时又不会损失质粒的产量，使得质粒产量较高。
16.优选的，所述溶剂为水。
17.通过采用上述技术方案，通过采用水为溶剂，曲拉通-114和异硫氰酸胍的溶解效果较佳，使得曲拉通-114和异硫氰酸胍能较好的相互反应实现偶联，得到的结合液去除内毒素的效果较佳，且不易损失质粒的产量，更好地去除内毒素的同时保障质粒产量。
18.第二方面，本技术提供一种内毒素质粒提取试剂盒，采用如下的技术方案：
19.一种去内毒素质粒提取试剂盒，所述去内毒素质粒提取试剂盒至少包括上述的结合液。
20.通过采用上述技术方案，采用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒时，无需萃取步骤，即可提取得到去内毒素的质粒，提取效率较高，内毒素去除效果较佳且较为稳定。
21.优选的，所述去内毒素质粒提取试剂盒还包括菌体重悬液、菌体裂解液、中和液、去蛋白洗涤液、脱盐洗涤液、洗脱液。
22.通过采用上述技术方案，通过菌体重悬液、菌体裂解液、中和液、去蛋白洗涤液、脱盐洗涤液、洗脱液的配合，质粒提取效果较佳。
23.第三方面，本技术提供一种去内毒素质粒提取方法，采用如下的技术方案：
24.一种去内毒素质粒提取方法，包括以下步骤：
25.步骤1)，将菌体与菌体重悬液混合得细菌重悬液；
26.步骤2)，加入菌体裂解液至细菌重悬液中，混匀，得细菌处理液；
27.步骤3)，加入中和液至细菌处理液中，混匀，取上清液；
28.步骤4)，加入结合液至上清液中，混匀，得混合液；
29.步骤5)，将混合液转移至吸附柱，离心过滤，弃滤液；
30.步骤6)，加入去蛋白洗涤液至吸附柱中，离心过滤，弃滤液；
31.步骤7)，加入脱盐洗涤液至吸附柱中，离心过滤，弃滤液；
32.步骤8)，去除吸附柱的乙醇；
33.步骤9)，加入洗脱液至吸附柱中，离心洗脱得去内毒素的质粒；
34.所述结合液为上述的结合液。
35.通过采用上述技术方案，通过将结合液加入至上清液中，无需萃取，即可去除内毒素，提取质粒的效率较高，去除内毒素的效果较好，质粒产量较高。
36.优选的，所述步骤4)中，结合液与上清液的体积比例为1：1。
37.通过采用上述技术方案，通过具体选择结合液与上清液的体积比例，使得去除内毒素的效果较佳，同时减少结合液过多导致柱吸附效率较低的情况，效率较高，效果较好。
38.优选的，所述步骤5)中，离心过滤时，最大相对离心力为13000g，离心30-60s。
39.通过采用上述技术方案，通过采用具体的工艺进行离心，使得质粒与滤液分离较为彻底，提取的质粒质量较佳。
40.综上所述，本技术具有以下有益效果：
41.1、由于本技术通过曲拉通-114和异硫氰酸胍在特定的浓度范围内复配，曲拉通-114和异硫氰酸胍能进行偶联，通过在提取质粒的过程中加入结合液，即可实现内毒素去除，减免了现有技术中先萃取再过柱的步骤，使得质粒提取可以更加高效快速，且不存在分层不明显的问题，去除内毒素的效果较佳且较为稳定、质粒产量较高。
42.2、本技术中优选通过采用水为溶剂，曲拉通-114和异硫氰酸胍的溶解效果较佳，使得曲拉通-114和异硫氰酸胍能较好的相互反应实现偶联，得到的结合液去除内毒素的效果较佳，且不易损失质粒的产量，更好地去除内毒素的同时保障质粒产量。
43.3、本技术的方法通过将结合液加入至上清液中，无需萃取，即可去除内毒素，提取质粒的效率较高，去除内毒素的效果较好，质粒产量较高。
具体实施方式
44.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
45.实施例1
46.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括以下组分：
47.溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114。
48.其中，溶剂为水。
49.异硫氰酸胍来源于市售，cas：593-84-0。
50.曲拉通x-114来源于市售，cas：9036-19-5。
51.去内毒素质粒提取用结合液的制备方法如下：
52.称量236.3g异硫氰酸胍加入至800ml纯水中，搅拌至异硫氰酸胍完全溶解，得异硫氰酸胍溶液，然后量取10ml曲拉通x-114加入至异硫氰酸胍溶液中，搅拌均匀，得混合液，然后将混合液注入1l的容量瓶中，然后再加入纯水定容至1l，得去内毒素质粒提取用结合液。
53.实施例2
54.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括以下组分：
55.溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114。
56.其中，溶剂为水。
57.异硫氰酸胍来源于市售，cas：593-84-0。
58.曲拉通x-114来源于市售，cas：9036-19-5。
59.去内毒素质粒提取用结合液的制备方法如下：
60.称量354.5g异硫氰酸胍加入至800ml纯水中，搅拌至异硫氰酸胍完全溶解，得异硫氰酸胍溶液，然后量取20ml曲拉通x-114加入至异硫氰酸胍溶液中，搅拌均匀，得混合液，然后将混合液注入1l的容量瓶中，然后再加入纯水定容至1l，得去内毒素质粒提取用结合液。
61.实施例3
62.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括以下组分：
63.溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114。
64.其中，溶剂为水。
65.异硫氰酸胍来源于市售，cas：593-84-0。
66.曲拉通x-114来源于市售，cas：9036-19-5。
67.去内毒素质粒提取用结合液的制备方法如下：
68.称量413.6g异硫氰酸胍加入至800ml纯水中，搅拌至异硫氰酸胍完全溶解，得异硫氰酸胍溶液，然后量取30ml曲拉通x-114加入至异硫氰酸胍溶液中，搅拌均匀，得混合液，然后将混合液注入1l的容量瓶中，然后再加入纯水定容至1l，得去内毒素质粒提取用结合液。
69.实施例4
70.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括以下组分：
71.溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114。
72.其中，溶剂为水。
73.异硫氰酸胍来源于市售，cas：593-84-0。
74.曲拉通x-114来源于市售，cas：9036-19-5。
75.去内毒素质粒提取用结合液的制备方法如下：
76.称量472.6g异硫氰酸胍加入至800ml纯水中，搅拌至异硫氰酸胍完全溶解，得异硫氰酸胍溶液，然后量取40ml曲拉通x-114加入至异硫氰酸胍溶液中，搅拌均匀，得混合液，然后将混合液注入1l的容量瓶中，然后再加入纯水定容至1l，得去内毒素质粒提取用结合液。
77.实施例5
78.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括以下组分：
79.溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114。
80.其中，溶剂为水。
81.异硫氰酸胍来源于市售，cas：593-84-0。
82.曲拉通x-114来源于市售，cas：9036-19-5。
83.去内毒素质粒提取用结合液的制备方法如下：
84.称量590.8g异硫氰酸胍加入至800ml纯水中，搅拌至异硫氰酸胍完全溶解，得异硫氰酸胍溶液，然后量取50ml曲拉通x-114加入至异硫氰酸胍溶液中，搅拌均匀，得混合液，然后将混合液注入1l的容量瓶中，然后再加入纯水定容至1l，得去内毒素质粒提取用结合液。
85.应用例1
86.一种去内毒素质粒提取试剂盒，包括菌体重悬液、菌体裂解液、中和液、结合液、去蛋白洗涤液、脱盐洗涤液、洗脱液。
87.菌体重悬液的制备方法如下：
88.分别称量三羟甲基氨基甲烷2.42g，葡萄糖9.91g，乙二胺四乙酸3.72g，将三羟甲基氨基甲烷、葡萄糖、乙二胺四乙酸加入900ml纯水中，搅拌至完全溶解，加入盐酸调ph至
8.0，得混合液，将混合液注入1l容量瓶中，再加入纯水定容至1l，得菌体重悬液。
89.菌体裂解液的制备方法如下：
90.分别称量氢氧化钠8g和十二烷基硫酸钠10g，将氢氧化钠、十二烷基硫酸钠加入900ml纯水中，搅拌至完全溶解，得混合液，将混合液注入1l容量瓶中，再加入纯水定容至1l，得菌体裂解液。
91.中和液的制备方法如下：
92.称量醋酸钾196.3g并加入至600ml纯水中，搅拌至完全溶解，得醋酸钾溶液，再用量筒量取100ml醋酸并加入至醋酸钾溶液中，混合均匀，得混合液，将混合液注入1l容量瓶中，再加入纯水定容至1l，得中和液。
93.去蛋白洗涤液的制备方法如下：
94.分别称量盐酸胍382g和三羟甲基氨基甲烷6g，将盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷加入至100ml纯水中，搅拌至完全溶解，得预混液，然后向预混液中加入盐酸调节ph至5.5，再用量筒量取300ml浓度为30％的异丙醇并加入至预混液中，混合均匀，得混合液，将混合液注入1l容量瓶中，再加入纯水定容至1l，得去蛋白洗涤液。
95.脱盐洗涤液的制备方法如下：
96.分别称量三羟甲基氨基甲烷2.4g和氯化钠10g，将三羟甲基氨基甲烷、氯化钠加入至500ml纯水中，搅拌至完全溶解，然后注入1l容量瓶中，然后加入纯水定容至1l。
97.洗脱液的制备方法如下：
98.称量三羟甲基氨基甲烷1.2g，将三羟甲基氨基甲烷加入至900ml纯水中，搅拌至完全溶解，加入盐酸调ph至8.5，然后注入1l容量瓶中，然后加入纯水定容至1l。
99.结合液为实施例1的结合液。
100.应用例2
101.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
102.结合液为实施例2的结合液。
103.应用例3
104.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
105.结合液为实施例3的结合液。
106.应用例4
107.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
108.结合液为实施例4的结合液。
109.应用例5
110.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
111.结合液为实施例5的结合液。
112.实验例1
113.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，包括以下步骤：
114.步骤1)，将菌体与菌体重悬液混合得细菌重悬液，具体如下：
115.步骤1-1)，加入0.5ml菌体重悬液至rnase a干粉中，吸打混匀10次让rnase a干粉充分溶解，于2℃保存，制得菌体重悬液/rnase a混合液。
116.步骤1-2)，将含质粒的大肠杆菌e.coli.接种于含有15ml氨苄青霉素培养液的培
养瓶中，37℃摇床培养16小时扩增质粒。检测细菌含量达到od600为0.8，得细菌培养液。
117.步骤1-3)，将细菌培养液在最大相对离心力为5000g的条件下，离心10分钟，收集10ml菌体。
118.步骤1-4)，倒弃培养基，在吸水纸上轻轻拍打吸尽残液。然后将菌体投入试管中，然后再向试管中加入500μl步骤1-1)制得的菌体重悬液/rnase a混合液，然后将试管放入旋涡仪中进行涡旋，使细菌充分重悬至看不到细菌团块，得细菌重悬液。
119.步骤2)，加入菌体裂解液至细菌重悬液中，混匀，得细菌处理液，具体如下：
120.向细菌重悬液中加入500μl菌体裂解液，颠倒混匀10次，室温放置3min，放置过程中，每隔1min颠倒混匀1次，得细菌处理液。
121.步骤3)，加入中和液至细菌处理液中，混匀，取上清液，具体如下：
122.步骤3-1)，向细菌处理液中加入250μl中和液，立即颠倒15次以混匀，试管中产生絮状沉淀且絮状沉淀均为均一白。
123.步骤3-2)，将试管放入离心机中，在最大相对离心力为13000g的条件下，离心10分钟，取上清液。
124.步骤4)，加入结合液至上清液中，混匀，得混合液，具体如下：
125.取步骤3-2)得到上清液0.95ml转移至离心管中，然后向上清液中注入0.95ml结合液，颠倒混匀5次，得混合液。
126.步骤5)，将混合液转移至吸附柱，离心过滤，弃滤液，具体如下：
127.将hipure dna mini column iii柱套在收集管中，转移750μl步骤4)制得的混合液至柱子中。在最大相对离心力为13000g的条件下，离心30s，弃滤液，把柱子套回收集管中，再转移750μl步骤4)制得的混合液至柱子中，在最大相对离心力为13000g的条件下，离心30s，弃滤液，再把柱子套回收集管中，把剩余混合液转移至柱子中，在最大相对离心力为13000g的条件下，离心30s，弃滤液。
128.步骤6)，加入去蛋白洗涤液至吸附柱中，离心过滤，弃滤液，具体如下：
129.把柱子套回收集管中，加入600μl去蛋白洗涤液至柱子中，在最大相对离心力为13000g的条件下，离心30s，弃滤液。
130.步骤7)，加入脱盐洗涤液至吸附柱中，离心过滤，弃滤液，具体如下：
131.把柱子套回收集管中，加入600μl脱盐洗涤液至柱子中，在最大相对离心力为13000g的条件下，离心30s，弃滤液。
132.步骤8)，去除吸附柱的乙醇，具体如下：
133.把柱子套回收集管中，在最大相对离心力为13000g的条件下，离心2min以干燥柱子去除乙醇。
134.步骤9)，加入洗脱液至吸附柱中，离心洗脱得去内毒素的质粒，具体如下：
135.把柱子套在灭菌的1.5ml离心管中，加入80ul洗脱液至柱子的膜中央，静置2min，在最大相对离心力为13000g的条件下，离心1min，洗脱质粒，得去内毒素的质粒，于-20℃下保存。
136.去内毒素质粒提取试剂盒为应用例1的去内毒素质粒提取试剂盒。
137.根据本实验例的方法分别进行高拷贝大肠杆菌e.coli.和低拷贝大肠杆菌e.coli.的质粒提取实验。
138.高拷贝大肠杆菌e.coli.为购置于上海禾午生物科技有限公司的pkd46大肠敲除质粒，货号p1247，pkd46大肠敲除质粒的部分信息如下：
139.启动子：arabad promoter。
140.复制子：psc101ori。
141.终止子：λtl3 terminator。
142.原核抗性：氨苄青霉素amp。
143.克隆菌株：大肠杆菌dh5α。
144.培养条件：lb培养基，30℃。
145.表达宿主：大肠杆菌。
146.诱导方式：阿拉伯糖。
147.低拷贝大肠杆菌e.coli.为购置于上海联祖生物科技有限公司的dh5α(含puc18质粒)大肠杆菌，货号lzj6620，dh5α(含puc18质粒)大肠杆菌部分信息如下：
148.种属：escherichia coli dh5α(puc18)。
149.培养基：lb培养基，含50μg/ml氨苄青霉素钠。
150.生长条件：37℃好氧。
151.实验例2
152.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
153.去内毒素质粒提取试剂盒为应用例2的去内毒素质粒提取试剂盒。
154.实验例3
155.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
156.去内毒素质粒提取试剂盒为应用例3的去内毒素质粒提取试剂盒。
157.实验例4
158.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
159.去内毒素质粒提取试剂盒为应用例4的去内毒素质粒提取试剂盒。
160.实验例5
161.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
162.去内毒素质粒提取试剂盒为应用例5的去内毒素质粒提取试剂盒。
163.对比例1
164.一种去内毒素质粒提取用结合液，与实施例3相比，区别仅在于：
165.采用盐酸胍等量代替异硫氰酸胍。
166.对比例2
167.一种去内毒素质粒提取用结合液，与实施例3相比，区别仅在于：
168.采用曲拉通x-100等量代替曲拉通x-114。
169.对比例3
170.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括以下组分：
171.溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114。
172.其中，溶剂为水。
173.异硫氰酸胍来源于市售，cas：593-84-0。
174.曲拉通x-114来源于市售，cas：9036-19-5。
175.去内毒素质粒提取用结合液的制备方法如下：
176.称量177.2g异硫氰酸胍加入至800ml纯水中，搅拌至异硫氰酸胍完全溶解，得异硫氰酸胍溶液，然后量取55ml曲拉通x-114加入至异硫氰酸胍溶液中，搅拌均匀，得混合液，然后将混合液注入1l的容量瓶中，然后再加入纯水定容至1l，得去内毒素质粒提取用结合液。
177.对比例4
178.一种去内毒素质粒提取用结合液，包括以下组分：
179.溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114。
180.其中，溶剂为水。
181.异硫氰酸胍来源于市售，cas：593-84-0。
182.曲拉通x-114来源于市售，cas：9036-19-5。
183.去内毒素质粒提取用结合液的制备方法如下：
184.称量649.9g异硫氰酸胍加入至800ml纯水中，搅拌至异硫氰酸胍完全溶解，得异硫氰酸胍溶液，然后量取5ml曲拉通x-114加入至异硫氰酸胍溶液中，搅拌均匀，得混合液，然后将混合液注入1l的容量瓶中，然后再加入纯水定容至1l，得去内毒素质粒提取用结合液。
185.对比应用例1
186.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
187.结合液为对比例1的结合液。
188.对比应用例2
189.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
190.结合液为对比例2的结合液。
191.对比应用例3
192.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
193.结合液为对比例3的结合液。
194.对比应用例4
195.一种去内毒素质粒提取试剂盒，与应用例1相比，区别仅在于：
196.结合液为对比例4的结合液。
197.对比实验例1
198.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
199.去内毒素质粒提取试剂盒为对比应用例1的去内毒素质粒提取试剂盒。
200.对比实验例2
201.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
202.去内毒素质粒提取试剂盒为对比应用例2的去内毒素质粒提取试剂盒。
203.对比实验例3
204.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
205.去内毒素质粒提取试剂盒为对比应用例3的去内毒素质粒提取试剂盒。
206.对比实验例4
207.一种应用去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒的方法，与实验例1相比，区别仅在于：
208.去内毒素质粒提取试剂盒为对比应用例4的去内毒素质粒提取试剂盒。
209.实验1
210.使用赛默飞nanodrop分光光度计检测各实验例及对比实验例的高拷贝大肠杆菌e.coli.、低拷贝大肠杆菌e.coli.的质粒产量。
211.实验1的具体实验数据详见表1。
[0212][0213]
实验2
[0214]
检测各实验例及对比实验例的高拷贝大肠杆菌e.coli.、低拷贝大肠杆菌e.coli.的质粒的内毒素。
[0215]
1、细菌内毒素溶液的配制：
[0216]
鲎试剂的配制：鲎试剂加1.7ml细菌内毒素水。
[0217]
显基质的配制：显基质加1.7ml细菌内毒素水。
[0218]
偶氮化试剂1的配制：偶氮化试剂1加9.2ml细菌内毒素水加800ul 1:1盐酸。
[0219]
偶氮化试剂2的配制：偶氮化试剂2加10ml细菌内毒素水。
[0220]
偶氮化试剂3的配制：偶氮化试剂3加10ml细菌内毒素水。
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2、细菌内毒素测试方法：
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制备样品：1ul各实验例及对比实验例制得的质粒+1ml细菌内毒素水，涡匀。
[0223]
取25ul样品加入25ul鲎试剂。
[0224]
上述试剂全部37℃避光温浴7min。
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温浴后加入25ul显基质，涡匀，37℃避光温浴5min。
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温浴后加入125ul偶氮化试剂1，涡匀。
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再加入125ul偶氮化试剂2，涡匀。
[0228]
再加入125ul偶氮化试剂3，涡匀。
[0229]
观察质粒显示在0eu,0.1eu,0.5eu,1eu的标准曲线上的位置，计算质粒的内毒素浓度。
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实验2的具体检测数据详见表2。
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表2
[0232][0233][0234]
根据表1及表2的数据可得，当结合液中含有异硫氰酸胍、曲拉通x-114的复配，且异硫氰酸胍、曲拉通x-114在特定浓度下配合时，去除内毒素的效果较佳，同时质粒的产量较高，而当采用其他胍盐替换异硫氰酸胍或采用其他曲拉通替换曲拉通x-114时，虽然也具有去除内毒素的效果，但去除内毒素的效果存在较为明显的下降，而且，导致质粒产量大幅降低，导致提取质粒的成本大幅提高，经济价值较差。
[0235]
而当采用异硫氰酸胍、曲拉通x-114复配，但异硫氰酸胍、曲拉通x-114未在特定浓度下配合时，去除内毒素的效果相较于改变复配体系的原料时要好，但仍旧明显低于异硫氰酸胍、曲拉通x-114在特定浓度下配合时去除内毒素的效果，同时，质粒的产量虽然相较于改变复配体系的原料时要高，但仍旧明显低于异硫氰酸胍、曲拉通x-114在特定浓度下配合时质粒的产量。
[0236]
综上，由于异硫氰酸胍、曲拉通x-114在特定浓度下配合，能产生特殊的偶联效果，从而实现去除内毒素的同时又不会损失质粒的产量的效果。
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本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：

1.一种去内毒素质粒提取用结合液，其特征在于：包括溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通x-114，所述异硫氰酸胍在结合液中的摩尔浓度为2-5mol/l，所述曲拉通x-114在结合液中的体积百分比为1-5%（v/v）。2.根据权利要求1所述的一种去内毒素质粒提取用结合液，其特征在于：所述异硫氰酸胍在结合液中的摩尔浓度为3-4mol/l，所述曲拉通x-114在结合液中的体积百分比为2-4%（v/v）。3.根据权利要求1或2所述的一种去内毒素质粒提取用结合液，其特征在于：所述溶剂为水。4.一种去内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述去内毒素质粒提取试剂盒至少包括权利要求1-3任一所述的结合液。5.一种根据权利要求4所述的去内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述去内毒素质粒提取试剂盒还包括菌体重悬液、菌体裂解液、中和液、去蛋白洗涤液、脱盐洗涤液、洗脱液。6.一种去内毒素质粒提取方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1），将菌体与菌体重悬液混合得细菌重悬液；步骤2），加入菌体裂解液至细菌重悬液中，混匀，得细菌处理液；步骤3），加入中和液至细菌处理液中，混匀，取上清液；步骤4），加入结合液至上清液中，混匀，得混合液；步骤5），将混合液转移至吸附柱，离心过滤，弃滤液；步骤6），加入去蛋白洗涤液至吸附柱中，离心过滤，弃滤液；步骤7），加入脱盐洗涤液至吸附柱中，离心过滤，弃滤液；步骤8），去除吸附柱的乙醇；步骤9），加入洗脱液至吸附柱中，离心洗脱得去内毒素的质粒；所述结合液为权利要求1-3任一所述的结合液。7.一种根据权利要求6所述的去内毒素质粒提取方法，其特征在于：所述步骤4）中，结合液与上清液的体积比例为1：1。8.一种根据权利要求7所述的去内毒素质粒提取方法，其特征在于：所述步骤5）中，离心过滤时，最大相对离心力为13000g，离心30-60s。

技术总结

本发明涉及质粒提取领域，具体公开了一种去内毒素质粒提取用结合液及试剂盒及质粒提取方法。一种去内毒素质粒提取用结合液，包括溶剂、异硫氰酸胍、曲拉通X-114，所述异硫氰酸胍在结合液中的摩尔浓度为2-5mol/L，所述曲拉通X-114在结合液中的体积百分比为1-5%（V/V）。本发明具有提高提取质粒的效率并且提高去内毒素的效果的优点。毒素的效果的优点。