王也飞;夏文权;倪培华;胡翊;姜叙诚
【摘 要】目的 对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症患者进行G6PD基因型分析,分析基因突变类型.方法 选取经G6PD活性测定确诊为G6PD缺陷症的49例患者和100名G6PD活性正常的体检者的全血标本,PCR和DNA测序法对G6PD基因外显子2～13进行序列分析.结果 49例G6PD缺陷症患者中,共发现12种错义突变,其中常见的三种为G6PD G1388A(26.5%)、G1376T(28.6%)和A95G(14.3%),此三类基因型患者G6PD活性仅为正常人的5%～18%.临床主要表现为新生儿黄疸、进食蚕豆后发生急性溶血性贫血等.其余突变类型包括C1024T(4.1%)、C1225T(2.0%)、C1159T(2.0%)、G487A(4.1%)、G392T(4.1%)、G1160A(6.1%)、G871A/C1311T(4.1%)和C406T/C1311T(2.0%);在外显子7上发现了一种新的错义突变即G691C,该突变造成G6PD第231位丙氨酸(Ala)被脯氨酸(Pro)替代.正常对照标本未发现相同的基因改变.结论 G6PD基因G1388A、G1376T和A95G是G6PD缺陷症患者最常见的三种突变类型.新发现的G691C突变导致Ala231Pro,是引起红细胞G6PD活性降低,患者临床出现溶血症状的主要原因.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(030)006
【总页数】5页(P698-702)
【关键词】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;错义突变;G691C;Ala231Pro
【作 者】王也飞;夏文权;倪培华;胡翊;姜叙诚
护肩路基【作者单位】上海交通大学,医学院瑞金医院检验系,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院检验系,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院检验系,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院检验系,上海,200025;上海交通大学,基础医学院病理学教研室,上海,200025
高炉喷煤【正文语种】中 文
【中图分类】R596;Q78
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)是一个看家酶，也是磷酸戊糖旁路途径的第一个限速酶，能催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸，同时生成还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)。NADPH不仅是体内多种物质合成的供氢体，也可维持谷胱甘肽的还原状态，保护红细胞免受氧化性损伤。G6PD缺陷症是人类最常见的遗传性缺陷病之一，为X连锁不完全显性遗传性疾病。在我国主要分布在广东、广西、海南、四川、云南和贵州等地[1]；发病率有地区差异，一般为4%～15%，个别可高达40%。患者常在进食蚕豆、服用药物或感染等诱因作用下产生急性黄疸、贫血和溶血，患有G6PD缺陷症的新生儿重者会出现核黄疸导致死亡，或者终生智力低下，危害极大。
编码G6PD的基因(G6PD；NG_009015)位于Xq2.8，全长18.5 kb，由13个外显子和12个内含子组成，外显子1位于非编码区，其余12个外显子位于蛋白编码区，大小为12～236 bp[2]。其cDNA为1 548 bp(GenBank：M21238)。基因点突变是引起G6PD缺陷的主要原因。迄今为止，世界范围内发现的G6PD基因突变已超过160种[3]，中国人中共发现28种突变[4]，主要存在于汉族、白族、基诺族、傣族和彝族等民族[5]。我国大陆地区的几种主要突变型有：G1376T、G1388A、A95G、C1024T、C592T、A493G、G487A和C1360android退出app
T。其中最为常见的是G1376T、G1388A和A95G，仅在华人中存在，世界其他各民族未见报道，这可能是中国人G6PD缺陷症的特征之一[6]。
本研究分析了49例G6PD缺陷症患者的基因突变型，以了解该病的发生情况及其基因型与表型之间的关系。
1 对象与方法
1.1 对象 从2006—2009年在上海交通大学医学院附属瑞金医院就诊的591例溶血性贫血患者中，筛选经G6PD酶活性测定确诊为G6PD缺陷症的患者作为研究对象。
新金瓶酶21.2 方法
1.2.1 标本采集：所有病例和采集2 mL静脉血，乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝处理。新鲜抗凝全血用于G6PD活性测定；剩余全血-20 ℃保存。
1.2.2 分光光度法测定红细胞G6PD活性：取新鲜抗凝全血标本，按Chapman和Dern法进行红细胞G6PD酶活性测定。所用试剂包括pH8.0的1 mol/L Tris-HCl缓冲液(含5 mmol/L ED
TA-Na2)；0.1 mol/L MgCl2；6 mmol/L G6P(Sigma G7250)，新鲜配制，4 ℃保存；2 mmol/L NADP (Genview DH209-1)，新鲜配制，4 ℃保存。采用UV-754型分光光度计进行比。该法测定的G6PD活性参考范围为2.8～7.3 IU·gHb-1·min-1(中山医科大学)。
1.2.3 PCR和DNA直接测序法分析G6PD基因：取经1.2.2筛查确诊为G6PD缺陷症患者的冻存全血标本，对G6PD基因第2～13外显子序列分析。另取体检中G6PD酶活性正常者的全血标本100份作为正常对照。①基因组DNA制备：采用Dneasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)进行全血DNA抽提。②引物的设计与合成：据GenBank中(NM_000402)人G6PD基因序列，设计克隆和表达所需引物(表1)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。③PCR扩增：先后在PTC-200 PCR仪和Bio-Rad S1000 PCR仪上进行扩增。反应体系25μL，取上述DNA模板3μL，10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP(Shanghai Promega，U120～123 AS)0.1μL，Taq酶(Shanghai Promega，M166B)1U，上、下游引物各0.1μL，50%甘油2μL，溴酚兰0.5μL，其余用双蒸水补至25μL，另加1滴石蜡油。PCR反应条件：外显子3-4、5和11的反应条件：94℃预变性5min；94℃ 40s、退火40 s、72℃ 90s，共35个循环；72℃延伸10 min；其中外显子3-4、5和11的退火温度为55℃，外显子2、6-7、8和9-10的退火温度为58℃，外显子12和13的退火温度为60℃。④电泳：PCR反应产物经2%琼
脂糖凝胶电泳，溴乙锭染后凝胶成像系统扫描，观察结果。⑤测序：将PCR产物进行测序。测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。
表 1 G6PD基因的12个外显子PCR引物Tab 1 Twelve G6PD gene primers for PCR and sequencing外显子引物序列(5 →3 )产物长度(bp)2上游: AATCAGGTGTCACCCTGGTGTGA342下游: CTCAACTTAGCAGAGCCTGTGGG3-4上游: AGTAGTGATCCTGAGTAGTGCC418下游: TCCCCGAAGCTGGCCATGCT5上游: GATGTGCAGAGCTGCTAAGAT469下游: CACGCTCATAGAGTGGTGGG6-7上游: ACAAGGCACGGGAGGTGGCCACG735下游: TCTGATAGCTCAGACACTTAGGT8上游: AGTCTTGCAGCTTGTCACTAGGA268下游: AGCTCAGTGCCTCGTCACAGATG9-10上游: TGAGGGCTGCACATCTGTGGCCA676下游: TCCACACTGCTCCTTCTCTGTAGG11上游: ACCTGACCTACGGCAACAGAT249下游: CCATAGCCCACAGGTATGCAG12上游: CTGCATACCTGTGGGCTATGG212下游: GCTGGGCTCTGTCCCCAG13上游: GATTGAGCTGGAGAAGCCCA939下游: GAGGAGGCTCCTCAGTGGCCACA
1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。不同突变基因型患者间G6PD活性的
比较，因数据呈非正态分布，采用Wilcoxon秩和检验进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 G6PD缺陷症患者筛查结果 591例溶血性贫血患者中共检出G6PD缺陷症患者49例，发病率为8.3%。患者均为汉族人；男46例，女3例；年龄13 d～56岁，平均年龄9岁，发病年龄主要分布在0～3岁。主要临床表现：新生儿黄疸；进食蚕豆或感冒后表现出急性溶血性贫血的症状；慢性非球形细胞溶血性贫血。49例患者红细胞G6PD活性值(0.60±0.59)IU·gHb-1·min-1，患者频数分布见图1。
2.2 G6PD基因突变的类型和频率 本研究发现，常见的三种突变型分别为G1376T(28.6%)、G1388A(26.5%)和A95G(14.3%)；国内首报三种突变型，即C1225T、C1159T和G1160A突变；国际首报两种突变型，即C406T/C1311T复合突变和G691C突变(表2)。
图 1 G6PD活性值及患者频数分布Fig 1 Frequencies of G6PD activity表 2 G6PD基因突变类型和频率Tab 2 Frequencies and types of G6PD gene mutations
高温气化炉热电偶 突变型氨基酸替代n频率(%)G1388A[7]Arg463His1326.5G1376T[7]Arg459Leu1428.6A95G[8]His32Arg714.3C1024T[9]Leu342Phe24.1C1225T[10]①Pro409 Ser12.0C1159T[11]①Arg387Cys12.0G487A[12]Gly163Ser24.1G392T[9]Gly131Val24.1G1160A[13]①Arg387His36.1G871A/C1311T[14]Val291Met24.1C406T/C1311T② Arg136Cys12.0G691C②Ala 231Pro12.0
①： 国内首报； ②： 国际首报
2.3 三种突变基因型患者的G6PD活性比较 常见的三种突变中，A95G突变型患者的G6PD活性与G1388A突变型比较差异有统计学意义(P<0.05)，与G1376T突变型比较差异无统计学意义(P>0.05)；G1388A突变型与G1376T患者间比较差异也无统计学意义(P>0.05)(表3)。
2.4 女性G6PD缺陷患者的基因型和表型特点 3例女性G6PD缺陷患者基因型见图2。患者G6PD活性分别为0.5、1.6和2.4 IU·gHb-1·min-1，临床表现为轻度贫血，Hb分别为93、106和103g/L。
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