抗肝癌组合物和苯乙双胍在制备抗肝癌药物增敏剂的应用

1.本发明属于医药

技术领域

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：，具体是涉及一种抗肝癌组合物和苯乙双胍在制备抗肝癌药物增敏剂的应用。

背景技术

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：：2.肝细胞癌，是最常见的肝癌类型，占原发性肝癌的90％。由于早期诊断困难，病情进展快，超过80％的肝癌患者确诊时已进展到中晚期，几乎没有有效的选择；且预后差，5年生存率仅15-18％左右。3.仑伐替尼(lenvatinib)是一种口服多激酶靶点抑制剂，由日本卫才(eisai)公司研发，可抑制血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、kit、ret等激酶。仑伐替尼也被fda批准用于晚期甲状腺癌和晚期肾癌患者，并于2018年被fda批准为肝癌的一线用药，目前与索拉非尼同为公认的不可切除肝癌的一线靶向药物。全球多中心iii期临床试验显示，尽管仑伐替尼的肿瘤客观缓解率与索拉非尼相比，从9.2％提高到了24.1％，但近80％的肝癌患者仍对仑伐替尼无效。4.为了增加药物的疗效，研究者们将目光聚焦在联合用药手段。小分子靶向药物和免疫药物联合、免疫靶向和免疫靶向联合、小分子与小分子靶向药物联合手段已经被应用到肝癌的临床前以及临床试验中。与单用相比，联合用药显示出更好的疗效和敏感性。如在一项肝癌临床试验中，小分子药物阿帕替尼和卡瑞利珠单抗联合用药不仅在疗效取得了很大的突破，而且在安全性方面亦有出的表现。另外一项仑伐替尼联合派姆单抗(一种抗pd-1抗体)用于不可切除肝癌患者的1b期临床试验表明，两者联用具有更好的抗肿瘤效果。此外，联合用药通过药物联用以降低单药用药剂量，由于药物作用机制各异，是一种克服耐药并降低毒副反应的有效方式。但是联合用药的方案选择非常不容易，因此寻有效、不良反应小、作用明确以及联合用药策略为提高仑伐替尼的临床效果成为当务之急。技术实现要素：5.本发明要解决的技术问题是提高抗肝癌药物的抗肝癌效果，提供一种抗肝癌组合物和苯乙双胍在制备抗肝癌药物增敏剂的应用。6.本技术实施例的内容为抗肝癌组合物，包括苯乙双胍(phenformin)和仑伐替尼。7.作为其中一个实施例，抗肝癌组合物由苯乙双胍和仑伐替尼组成。8.作为其中一个实施例，苯乙双胍和仑伐替尼的摩尔比为10-100:1。9.作为其中一个实施例，还包括药学上的辅料、载体、赋形剂或媒介物，上述抗肝癌组合物可以制成口服片剂或口服胶囊。10.本技术实施例还提供一种苯乙双胍在制备抗肝癌药物增敏剂的应用，所述抗肝癌药物为仑伐替尼。11.本发明的有益效果是，本发明将苯乙双胍和仑伐替尼联用，有效的提高抗肝癌效果。12.本发明采用mtt方法及compusyn软件计算ci值，结果显示在肝癌hepg2细胞中，相比仑伐替尼和苯乙双胍单独给药，仑伐替尼和苯乙双胍体外联用具有协同抗肿瘤作用。相较其他肝癌临床所用药如索拉非尼，苯乙双胍联合仑伐替尼比苯乙双胍+索拉非尼以及索拉非尼+仑伐替尼的ci值更低，具有更好的联用效果；且相较于二甲双胍，苯乙双胍增敏仑伐替尼的效果更显著。采用单用、联用处理一定时间，观察hepg2细胞克隆形成，进一步发现苯乙双胍可以协助仑伐替尼进一步抑制肿瘤细胞增殖。通过建立裸鼠hepg2细胞皮下成瘤模型，确定动物体内仑伐替尼与苯乙双胍联用组较单药组具有更显著的体内抗肿瘤作用。2020年发表在journalofclinicaloncology的论文“phaseibstudyoflenvatinibpluspembrolizumabinpatientswithunresectablehepatocellularcarcinoma”中仑伐替尼使用的剂量为：8mg/d(体重小于60kg)，12mg/d(体重大于等于60kg)，该剂量根据徐叔云教授主编的《药理实验方法学》中等效剂量换算方法，换算成小鼠使用剂量为62.4mg/kg/d，而本发明中仑伐替尼使用的剂量为3.2mg/kg，每周5次给药频率，明显小于目前公开的仑伐替尼使用剂量。本发明通过3.2mg/kg剂量的仑伐替尼联合苯乙双胍的增效作用是显而易见性的，具有明显的优点。通过westernblot检测研究发现仑伐替尼与苯乙双胍联用能有效的激活ampk途径。不仅从体内外验证仑伐替尼与苯乙双胍联用均具有明显的协同抗肿瘤作用，重要的是，阐明了两者协同抗肿瘤作用的机制，应用基础理论扎实，将推动仑伐替尼和苯乙双胍在肿瘤临床中的应用，具有重要意义。附图说明13.图1：苯乙双胍协同仑伐替尼发挥抗肿瘤活性及其联用指数图，即ci值；ci《1表示协同作用，ci＝1表示相加作用，ci》1表示拮抗作用。14.图2：二甲双胍协同仑伐替尼发挥抗肿瘤活性及其联用指数图，即ci值；ci《1表示协同作用，ci＝1表示相加作用，ci》1表示拮抗作用。15.图3：索拉非尼协同仑伐替尼发挥抗肿瘤活性及其联用指数图，即ci值；ci《1表示协同作用，ci＝1表示相加作用，ci》1表示拮抗作用。16.图4：苯乙双胍协同索拉非尼发挥抗肿瘤活性及其联用指数图，即ci值；ci《1表示协同作用，ci＝1表示相加作用，ci》1表示拮抗作用。17.图5：苯乙双胍协同仑伐替尼抑制肝癌细胞的克隆形成图。18.图6：本技术实施例提供的成瘤小鼠给药苯乙双胍、仑伐替尼以及二者联用后裸鼠肿瘤组织的重量、体积以及小鼠体重变化对比图。19.图7：仑伐替尼和苯乙双胍联用引起体内外p-ampk蛋白表达水平升高图。具体实施方式20.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。21.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。22.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。所述苯乙双胍购自于阿拉丁试剂上海有限公司。仑伐替尼购自上海芮晖化工科技有限公司。索拉非尼购自上海medchemexpress公司。二甲双胍购自北京华润双鹤公司。23.实施例1：仑伐替尼和苯乙双胍对肝癌细胞体外抗肿瘤联用作用24.运用mtt方法，在肝癌hepg2细胞株上，将仑伐替尼和苯乙双胍进行联用，对比单用与联用的体外抗肿瘤作用。利用compusyn软件，苯乙双胍选择2个浓度，仑伐替尼选择5个浓度，计算ci值。25.具体操作如下：在dmem培养基中加入10％的胎牛血清溶液，将hepg2细胞以8000个/孔/180μl的密度接种于96孔板中，在温度为37℃，5％co2条件下培养24h后，将不同浓度的药物用新鲜培养基稀释后，每孔20μl加入已加细胞的培养板中，联用组为10μl仑伐替尼+10μl苯乙双胍，仑伐替尼单药组为10μl仑伐替尼+10μl培养基，苯乙双胍单药组为10μl苯乙双胍+10μl培养基，每个浓度至少设三个复孔以减少实验误差。另设对照组(加细胞不加药)和空白组(不加细胞也不加药，仅含培养基)。26.37℃，5％co2条件下培养72h后，以50μl/孔体积加入mtt试剂(2mg/ml)，继续孵育5h。去掉培养基，加入150μl二甲亚砜，震荡混匀15min，酶标仪检测每孔od值，检测波长490nm。根据od值读数，计算细胞的存活率，并使用grapadprism6计算ic50。利用compusyn软件，计算ci值。结果显示，仑伐替尼与苯乙双胍在肝癌细胞中有较强的协同抑制作用，ci值＜0.5，说明有强的协同作用。见图1。27.仑伐替尼+二甲双胍(图2)，仑伐替尼+索拉非尼(图3)，苯乙双胍+索拉非尼(图4)等不同药物组合以相同方法处理，mtt结果显示，对比其他三种药物组合，苯乙双胍和仑伐替尼的联用指数最小，协同作用最好。具体见图1-4。28.实施例2：采用克隆形成试验，在肝癌细胞株hepg2细胞中，比较仑伐替尼与苯乙双胍单独用药和联合用药的抗肿瘤作用。29.具体操作如下：2000个细胞接种于24孔板中，0.9ml培养液混匀，每组设3个复孔。24h待细胞贴壁后，将药物用新鲜培养基稀释后，每孔100μl加入上述已加细胞的培养板中。联用组为50μl仑伐替尼+50μl苯乙双胍，单药为50μl药液+50μl培养基，对照组为100μl培养基。设置给药作用时间为8天。置37℃，5％co2条件下连续培养。8天后，克隆长至直径1-2mm时，终止培养。弃上清，用pbs洗2次。每孔加入10％多聚甲醛2ml，固定15min。去除固定液，0.5ml结晶紫染液染15min。清水洗去染液，室温晾干。拍照并采用酶标仪检测吸光值，波长为550nm。结果显示，与单用仑伐替尼或苯乙双胍相比，两药联用组进一步抑制肿瘤细胞增殖，如图5。30.实施例3：动物模型试验31.构建hepg2肝癌裸鼠模型，研究动物体内仑伐替尼与苯乙双胍联用抗肿瘤作用。32.具体操作如下：收集生长状态良好的hepg2细胞，培养基重悬细胞并计数，置于冰上。将细胞混匀，向体重18g-20gbalb/c雌性裸鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司)腋下注射5×106/100μl的hepg2细胞。待裸鼠皮下长出肿瘤70-100mm3(约10天)，开始给药，给药体积100μl。实施组别分别为：溶媒组；仑伐替尼-3.2mg/kg组；苯乙双胍-80mg/kg组；仑伐替尼-3.2mg/kg+苯乙双胍-80mg/kg组。其中仑伐替尼用dmso配制成64mg/ml的母液，苯乙双胍用0.5％甲基纤维素配制成16mg/ml的母液；吸取8μl的dmso或64mg/ml的仑伐替尼母液，用100μl0.5％甲基纤维素或100μl16mg/ml苯乙双胍溶液稀释配制成相应的给药溶液，药物现配现用。给药频率为一天一次，灌胃给药，一周5次，持续2周。使用游标卡尺测量肿瘤大小，每天记录1次，图6的左下图记录了给药第14天的肿瘤组织大小。记录肿瘤的长度(l)和宽度(w)，肿瘤大小可计算为肿瘤体积＝(l×w2)/2。根据裸鼠的肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线。处死裸鼠并将肿瘤取出，计算肿瘤重量，作统计分析。结果显示，仑伐替尼与苯乙双胍联用组明显抑制裸鼠的肿瘤生长，如图6。33.实施例4：westernblot检测ampk的磷酸化水平。在hepg2细胞和动物肿瘤组织中考察仑伐替尼和苯乙双胍对p-ampk的表达水平。34.试验具体步骤如下：设置四个组(设置仑伐替尼、苯乙双胍、仑伐替尼+苯乙双胍的处理组，同时设置无药物处理组为对照组)，细胞水平仑伐替尼的浓度为4μm，苯乙双胍的浓度为100μm。在药物处理适当时间(细胞处理12h，动物给药2周)后，收集细胞或动物组织提取蛋白，westernblot检测p-ampk蛋白表达水平。图7a为动物肿瘤组织，图7b为hepg2细胞中p-ampk的蛋白表达水平。结果显示仑伐替尼和苯乙双胍能一定程度上调p-ampk蛋白表达，而联用进一步上调p-ampk，说明苯乙双胍能增加仑伐替尼激活ampk的能力。35.所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本技术的保护范围限于这些例子；在本技术的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本技术中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。36.本技术中一个或多个实施例旨在涵盖落入本技术的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本技术中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种抗肝癌组合物，其特征是，包括苯乙双胍和仑伐替尼。2.如权利要求1所述的抗肝癌组合物，其特征是，由苯乙双胍和仑伐替尼组成。3.如权利要求1或2所述的抗肝癌组合物，其特征是，苯乙双胍和仑伐替尼的摩尔比为：10-100:1。4.如权利要求1或2所述的抗肝癌组合物，其特征是，还包括药学上的辅料、载体、赋形剂或媒介物。5.苯乙双胍在制备抗肝癌药物增敏剂的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述抗肝癌药物为仑伐替尼。

技术总结

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗肝癌组合物和苯乙双胍在制备抗肝癌药物增敏剂的应用，上述抗肝癌组合物，包括苯乙双胍和仑伐替尼；本申请提高抗肝癌药物的抗肝癌效果。果。果。

技术研发人员：

杨小平 李朵 肖迪

受保护的技术使用者：

湖南师范大学

技术研发日：

2022.10.08

技术公布日：

2022/12/1