食品中单增李斯特氏菌的检测与计数李斯特有6种菌种：L.innocua , L.seeligcri , L.welshimeri , L.ivanovii , L.grayi、L.grayi和L.ivanovii含有2个亚种，这里不作明确分析。Rocourt最新的细菌分类法代替了以前的分类法。L.ivanovii与单增李斯特氏菌是老鼠和其他动物的致病菌，然而，只有单增李斯特氏菌是人类致病菌，L.ivanoviij与L.seeligeri在人类中很少见。近来，我们充分讨论了食品中单增李斯特氏菌的存在性，及其传染性详细资料。因而本篇重点介绍单增李斯特氏菌的鉴定与计数。食品加工过程中，例如食品接触表面及加工工具的致病原检测就不作介绍了。分离与检测单增李斯特氏菌快速有效的方法如下：以污染的食品为样品，通常据FDA实验规则，样品是混合物。待分析的部分样品放入BLEB（奶制品放入AOAC或IDF）中，30℃培养4h，进行李斯特菌选择性增菌。在第四个小时加入选择剂：acriflavin（10mg/L），sodium nalidixate（40mg/L），optional antifungal，cycloheximide（50mg/L）。然后继续培养48h，在24h和48h时，将培养物划线接种于不同的选择性培养基来分离李斯特菌。有些快速检测到李斯特菌的存在。先在标准增菌液或呈现阳性的增菌液中进行李斯特菌增菌，之后划线到选择培养基上进行纯化，然后在非选择培养基上纯化，最后通过常规检测实验或一系列生化实验来确定是否为单增李斯特氏菌。利用具体实验，分离物会快速地被鉴定是否为单增李斯特氏菌。FDA规则中，必须依照血清类型`PFGE及核糖类型分类。利用选择性培养基的菌落计数及MPN计数法可以对单李进行计数。（MPN计数法是先用BLEB选择性增菌，再涂布于ALOA或BCM选择性培养基上）
主要内容如下：
1．增菌液及快速检测实验是可以选择的
2．可用任一种选择分离培养基（OXA 、PALLCAM 、添加七叶苷和三价铁的LPM 、MOX）来代替两种选择性培养基。OXA仍为标准的选择分离培养基，MOX也可使用，没加七叶苷和三价铁的LPM已不再使用。BCM 、ALOA 、CHROM 、L.mono也会尝试着被使用，从而将单李与L.ivanovii从其它李中分离出来，并易于挑取单菌落。
弯曲弹簧
3．Henry
4．目前使用的增菌液基本没有改变，与国际上通用的Asperger et al.(10a)增菌方法的第一步相似.然而，毒性小于的萘啶酮酸，作为选择性抗真菌剂，被加入到增菌液中
5．若食品中检测出单增李斯特氏菌，就需要计数图表1 李斯特菌的鉴别(见页码2/22) a. 羊血琼脂穿刺b. 小鼠毒力实验c. 糖发酵培养基：发酵Ribose的是L.ivanovii亚种.ivanovii，不发酵vibose的是L.ivanovii亚种.londiniensis d. V，不同生物类型 e. 硝酸盐还原试验：硝酸盐减少的是L.grayi亚种.murrayi，硝酸盐不减少的是L.grayi亚种grayi A. 设备与材料: 1. 天平称取0.1g样品2. 盖玻片 3. 500ml 三角瓶 4. 发酵管 5. 记号笔
安全带插扣
6. 30℃和35℃的培养箱.
7. immersion oil牙刷消毒器
8. 接种环
9. 接种针
周薄10. 载玻片
11. 直径为26mm，长为3-8尺的针
12.显微镜
13.Petri plates
14.25ml ,10ml ,1ml的移液管
工作帽
15.16×125mm的试管及塞子
16.混匀器
17.无菌注射器
风力发电机叶片设计B.培养基与试剂: 1.醋酸5mol/L 2.开汞3.琼脂4.N-二胺乙烯5œ.-萘酚
6.二号血琼脂基础
7.
8.Natamycin(pimaricin)
9.脱纤维羊血10.无水乙醇11.荧光抗体缓冲液12.氨基乙酸13.革兰氏染液14. 3% H2O2溶液15. 40% KOH溶液16.血清学装置17.加七叶苷和三价铁的LPM 18.钠盐19.硝酸盐肉汤与硝酸盐试剂20.营养肉汤21.0.85%生理盐水22.糖发酵培养基23.半固体动力培养基24.硫酸试剂25. TSAye 26. TSBye 27. OXA 28. BLEB 29. PALCAM 30. BCM培养基31. MOX培养基32. ALOA培养基33.显培养基34. Carageenan(sigma tyjpe II) 35. Rapid L¹mono 36.CHROMagar 李斯特
37.胰蛋白胨肉汤与琼脂
C.样品处理与增菌: 1.样品处理: 将样品保存于4℃冰箱中，若条件允许, 单增李斯特氏菌会缓慢生长，然而，若样品已被冷冻，则应在进行检测前解冻 2.样品混合液的制备: 无菌操作从10个样品中各取50
ml或50g，每五种样品混合成一份250ml 或250g，共分两份(注意取样要均匀).两份混合液都加入250ml的BLEB，振荡混匀.每份样品匀液各取50ml(固体取25ml)分别放入200ml BLEB中，同时再各取50ml(固体取25ml)置于5℃冰箱中保存，以备计数. 3.非混合液的制备: 若不需要样品混合物，则只需取25g样品放入225ml的BLEB中，混匀，增菌培养.同时贮存25g样品以备计数.非冷冻样品，应置于5℃下保存；冷冻样品置于保鲜冰箱中保存，不能冷冻. 4.前增菌与增菌: 30℃培养4h，后加入选择性试剂，继续30℃培养48h.若没有cycloheximide，也可用25mg/L的natamycin代替，且比cycloheximide更安全.巴氏消毒乳、乳制品、酸乳酪、冷冻水产品等，含有较少的酵母菌和较少霉菌，因此不需加入抗菌剂.但生乳、干的海产品或新鲜产品则需加入抗菌剂. 5.增菌与计数：首先检测是否含有单增李斯特氏菌，若含有，则需对贮存样品进行计数，很少一部分样品被检测出是阳性的，大部分样品只含有1cfu/25g的单李，因此这种方法是首选的，目前将常规检测与计数结合在一起. 6.增菌样品的检测实验：图表2中遵照AOAC国际规则列举了一系列检测李的生化试验，这些生化试验只适合于检测第十章增刊1B列举的试验方法，这些方法在国内是可行的.最简单的检测方法如下：将生化鉴定为非李的菌增菌培养48h，划线接种于七叶苷琼脂，并选取样品的五个不同部位进行重复实验来确定其可信度.而结尾的检测方法则没有考虑，样品不同部位的质量及取样数量对结果的影响.食品检验更注重检测方法而不是培养方法.检测实验比平板培养需要较高的菌浓度，检测实验菌浓度>10000cfu/ml，平板培养大约100cfu/ml.因此，若增菌液中浓度太低，试验结果可能会给出错误的阴性结果. 单增李斯特氏菌图表2 李斯特菌的检测实验(见页码4/22) A. 通用常规检测: 1.AOAC官方检测方法993.09.2000 乳制品`海产品
`肉制品中李斯特 B. 非通用常规检测D: 分离纯化: 在24和48h时，挑取BLEB上的菌落划线接种于含七叶苷的选择分离培养基上：OXA、PALCAM、MOX或加入七叶苷和三价铁
的LPM。以上含七叶苷的培养基根据具体要求而选用。OXA、PALCAM、MOX 平板接菌后放置于35℃培养24-48小时，含七叶苷和三价铁的LPM平板接菌后放置于30℃培养24-48小时。特别推荐以下单增李斯特氏菌与绵羊李斯特氏菌所用的选择性培养基，例如BCM(33，M117a)、ALOA(M10a)、Rapid单增李斯特氏菌培养基(M131a)、或CHROMagar 李斯特氏菌培养基(M40a)培养48小时( 也可培养24小时)，这样可以减少绵羊李斯特氏菌掩盖单增李斯特氏菌。[注：BCM 培养基已被FDA证实有效。ISO TC34 SC9认证机构证实所有的培养基(和一种选择性的血琼脂培养基-LMBA，Sifin，德国)都能或多或少地抑制非李斯特氏菌的生长。ALOA的配方已公开，其是首选培养基。Chromogenic李斯特氏菌作为一种选择性培养基其配方也会公开。在含七叶苷的培养基上，李氏菌呈黒，菌落周围具有黒的环。一些其它的细菌在两天以后或更长的时间，能够形成淡棕黒的菌落。从OXA、PALCAM、改良LPM培养基或MOX培养基上，挑取5个典型菌落划线接种到TSAye培养基上，分离纯化单菌落。同样也可划线接种到BCM培养基，单增李斯特氏菌呈蓝，而绵羊李斯特氏菌在食品中不常见。单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌在ALOA培养基下都呈蓝且在菌落周围有酯酶环。在传统的检测方法中，利用TSAye培养基进行菌落纯化是必须的，因为选择性培养基上分离出的菌落仍有可能包涵有其它细菌。至少挑取5个菌落，由于在同一样品中可能含有几种李斯特氏菌。BCM和ALOA培
养基可以减少挑取的菌落数。运用商业的Confirmatory培养基(Biosynth International,Inc.)，或传统的木糖/鼠李糖发酵肉汤或琼脂，可以区别单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌。TSAye平板需在30℃培养24-48小时，若不需观察运动，也可在35℃培养。对于这些认可的方法，可以用选择性琼脂进行分离李斯特氏菌，也可以辅助使用推荐的新的单增李斯特氏菌-绵羊李斯特氏菌分离培养基。E、鉴定过程分离纯化过程可用以下经典的方法(E,1-11)，也可用快速试剂盒进行生化试验来区别基因型或种(见-11和E-12)。1、检测TSAye平板上的典型菌落形态，用斜射光观察是非常有帮助，但不是必须的(详见ref.25)。2、从30℃或低于30℃培养的平板上挑取生长良好的典型菌落，涂于洁净载玻片上，用0.85%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片于相差显微镜的油镜下观察。李斯特氏菌为短杆状，有轻微的旋转和翻滚运动。而大的杆状，或快速运动的杆状细菌则不是李斯特氏菌。应用阳性的李斯特氏菌做对照。3、过氧化氢酶试验：李斯特氏菌阳性反应。4、革兰氏染试验：将培养16-24小时的培养物进行染。李斯特氏菌呈短杆状阳性菌。但若培养时间过长，染会发生变化。细胞呈现Coccoidal菌现象。着轻的部位呈现栅栏状，被当作类白喉菌排除掉。5、挑取典型菌落接种到TSBye 培养基(进行糖发酵试验)和其它检测培养基上，35℃培养24小时，这些培养物可置于4℃冰箱中保存数天，以重复利用。商业化的试剂盒也可于分离鉴定(见E-11)。6、溶血试验：将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从TSAye 上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，于35℃培养24-48小时，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。7、于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特
氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，绵羊李斯特氏菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。(注意：当血平板的厚度比通常的5mm更薄时，非常容易观察到溶血环，另外这可以通过覆盖一层血琼脂1-2mm来实现)。
8、硝酸盐还原试验：这个试验是非必需的。只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸盐，从而区别开格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用TSBye肉汤培养物接种到硝酸盐肉汤中，35℃培养5天，加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂B，混匀，如出现紫红，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜变化，则加入少量锌粉，放置1小时，如出现红，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。也可按以下过程进行检测：加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂C，混匀，如出现桔红，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜变化，则加入少量锌粉，放置1小时，如出现桔红，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。9、动力试验：由TSBye肉汤培养物接种到SIM培养基或MTM培养基，室温培养7天，逐日观察，李斯特氏菌有动力，呈伞状生长。从MTM培养基上形状尤为突出，可以明显观察到伞形。另外，通过相差显微镜，可以观察30℃TSBye培养基上的培养物的翻滚运动。10、糖发酵试验：将TSBye上培养物接种于含以下0.5%糖的紫肉汤中(可加入小倒管)：葡萄糖、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培养7天。阳性反应是产酸不产气。不同菌种的生化反应见表1。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖都是阳性反应。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外的李斯特氏
菌对甘露醇呈阴性反应。若OXA、PALCAM、MOX 或LPM(加七叶苷和三价铁)的纯化物着是确定的，则七叶苷发酵实验可省略。
11、可以用商业化的试剂盒对纯培养物进行快速鉴定（用于种的鉴定时需做补通试）。有革兰氏阴性与阳性菌鉴定卡、不需CAMP试验的API、MICRO-IDTM (CAMP试验确定后，用MICRO-IDTM可区别李斯特氏菌各个种)、李斯特氏菌生物型分析卡。12、另一种快速鉴定李斯特氏菌的方法见图表3。用纯培养物或从OXA、其它选择性分离培养基上挑取菌落进行鉴定。单增李斯特氏菌这些分离纯化鉴定实验要作为常规实验来应用。表3. 确证是否为单增李斯特氏菌的有用试剂盒1、AccuProbeTM 单增李斯特氏菌培养物确证检测试剂盒(Gen-Probe,Inc,San Diego,CA;10) 2、GeneTrak 单增李斯特氏菌检测试剂盒(Neogen,Lansing,MI;19). 3、Probelia 单增李斯特氏菌检测试剂盒(BioControl,Seattle,WA). 4、VIDAS单增李斯特氏菌检测试剂盒(bioMerieux). 5、Transia单增李斯特氏菌平皿(Diffchamb SA,Lyon,France). 6、FDA,SRL的应用，PCR方法检测和鉴定单增李斯特氏菌。*这些试剂盒是适用于不同的培养时间的单增李斯特氏菌检测。若选择合适的时间，才可以用来鉴定单增李斯特氏菌的增菌物。此处，FDA只是规定了用来鉴定所有李斯特氏菌的有效试剂盒。F、CAMP试验：当溶血试验结果不确定时，可用CAMP实验来区别李斯特氏菌的各个种。在羊血琼脂平板上划两条平行线，两条线上分别接种β型溶血金黄葡萄球菌与马红球菌培养物。在该两线之间，垂直划线，接种待测培养物，与两线相近但不相交，于35℃培养24-48小时后，观察溶血情况。单增李斯特氏菌与西尔李斯特氏菌
在靠近金黄葡萄球菌接种点附近的溶血增强，其它李斯特氏菌不溶血。单增李斯特氏菌在24小时溶血现象比在48小时更明显。为使马红球菌能长出一条很好的划线，需要将斜面培养物培养48小时，而不是24小时。同时，羊血琼脂平板需新鲜配制。表4 李斯特氏菌菌种协同溶血作用试验(CAMP) 协同溶血金黄葡萄球菌马红球菌单增李斯特氏菌绵羊李斯特氏菌英诺李斯特氏菌威尔斯李斯特氏菌西尔李斯特氏菌+ - - - + -* + - - - *S+和R+的菌种是非常稀少的，R+反应除绵羊李斯特氏菌外很少见报道。CAMP试验菌种可菌种保存中心获得，包括ATCC，Manassas,V A. G、李斯特氏菌的分类：按FDA标准分离出的李斯特氏菌应按血清型和遗传性进行分类。1、血清类型分类：利用
标准血清类型将李斯特氏菌分为类型1、4或3、5、6等图表5、各种李斯特氏菌的血清类型李斯特氏菌菌种血清类型单增李斯特氏菌1/2a,1/2b,1/2c 3a,3b,3c, 4a,4ab,4b 4c,4d,4e,”7”绵羊李斯特氏菌 5 英诺李斯特氏菌4ab,6a,6b,Una 威尔斯李斯特氏菌6a,6b 西尔李斯特氏菌1/2b,4c,4d,6b,Un 图表5表明了李斯特氏菌各种之间的血清关系，大多数单增李斯特氏菌从病人身上获得，周围环境类型是1或4，多于90%的单增李斯特氏菌能被确定血清类型。除威尔斯李斯特氏菌外的所有非致病的菌种与单增李斯特氏菌具有同一个或多个抗原。特征不完全确定的血清类型是不能鉴别出单增李斯特氏菌的。血清学可用于研究流行病。TSB-YE培养物接种到酪蛋白胨肉汤中，35℃培养24h，在该温度下，鞭毛（H）抗原表达能力降低。然后再接种到酪胨琼脂斜面，35℃培养24h，用3mlFA缓冲液冲洗两个琼脂斜面，并将洗液转移到无菌的16*125mm试管中，盖上塞子，80℃水浴加热1h，1600转/min离心30min，除
去2.2-2.3ml的上清液，将底部的沉淀再次悬浮于剩下的缓冲液中，按说明将血清进行稀释、凝集实验。若鞭毛（H）或菌体（O）血清类型符合，看11章。2．遗传学分类：FNA分离物的DNA限制性酶切片段的PFGE应送到PulseNet也应坚定核糖类型或送到核糖鉴定实验室。H.小鼠毒力实验。检测李斯特氏菌的致病性传统实验是Anton相交实验，既小鼠注射实验和鸡胚注射实验。小鼠抵抗力测定实验是将细菌从腹腔注入，该实验有很高的敏感性，单增李斯特氏菌对动物的致病性，对于临床分离来说是不需要确定的，对于食品来说是可以选择的。当分离物满足本章中列举的其他标准时，也可判定分离物为单增李斯特氏菌。将4mgCarageenan(sigma tyjpe II)溶解在蒸馏水中，注射到18-20g重的小鼠体内，24h 后，李斯特氏菌开始表现毒性。小鼠体内的Carageenan(sigma tyjpe II)注射量应依据小鼠的体积，一般注射量为；每1kg体重注射200mgCarageenan(sigma tyjpe II)，。分离物在TSB-YE中35℃培养24h后，再转移到两个管中，35℃培养24h，然后再将10ml的肉汤培养物转移到16*150管中，1600转/min离心30min，弃上清，用1ml灭菌生理盐水制成菌悬液，此时菌浓度为1010/ml，稀释105/ml，将0.1ml菌悬掖注射到16-18g重的Swiss小鼠体内，（每组5只），约注入104个菌，观察5d内小鼠的死亡情况。非致病菌不会杀死小鼠。用致病菌、非致病菌、Carageenan(sigma tyjpe II)处理的小鼠及未注射的小鼠作对照实验。每组实验用5只小鼠，Carageenan(sigma tyjpe II)处理的小鼠，应该能够忍受0.1ml的PBS。I 实验数据解释：分离物的所有特征都不能忽视。部分特征尽管准确，但容易引起误导。所有的李斯特氏菌在吲哚实验、氧化酶实验、尿素酶实验，有机硫化物的产H2S实验（H2S是在MICRO ID实验中由硫酸盐产生的），都是阴性的，甲基红和V-P实验是阳性的，这些实验
是独立的。与李斯特氏菌在种属上很相近的Brochothrix，却不能在35℃生长，因而，可将两者区别开。Erysipelothrix与Kurthia，属革蓝氏阳性菌，不能产生孢子且不能运动，在李斯特氏菌分析中很少见，但能在其他地方发现。李斯特氏菌体积很小，为过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性菌，在溶液及SIM中可以运动。他们能利用葡萄糖，七叶苷，麦芽糖。一些李斯特氏菌能利用鼠李糖。绵羊李斯特氏菌与西尔李斯特氏菌可用CAMP实验区别开。西尔李斯特氏菌在金黄葡萄球菌线上有溶血现象，绵羊李斯特氏菌再马球菌线上有溶血现象。所有的非溶血菌中，英诺克李斯特氏菌与单增李斯特氏菌一样，能产生相同的鼠李糖-木糖反应，英诺克李斯特氏菌为CAMP实验阴性，英诺克李斯特氏菌利用木糖有时呈阴性结果。目前，普遍认同英诺克李斯特氏菌为非溶血性菌，单增李斯特氏菌为溶血性菌，因此，英诺克李斯特氏菌为溶血菌的说法
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