鲍延娥;董晓芳;佟建明;高玉鹏;刘炎
【摘 要】通过体外法研究粪肠球菌的生长特点、耐酸性、耐胆盐性和抑菌性等,以评价其益生效果.结果表明:①粪肠球菌在培养2h后进入对数期,8h到达稳定期;②经pH 2、3、4的人工胃液处理3h后,粪肠球菌极显著降低至2.71×105、1.03×107和5.65×107 CFU/mL(P＜0.01);③粪肠球菌经含质量分数为0.2％和0.3％的胆盐溶液处理3h后,极显著降低至1.46×106和1.37×106 CFU/mL(P＜0.01);④粪肠球菌对大肠杆菌O1和O78均在混合培养至10h时表现极显著的抑制作用(P＜0.01).可见,粪肠球菌生长繁殖速度快,能耐受胃肠道环境,对大肠杆菌O1和O78有一定的抑制作用,适合作为微生态制剂的生产菌种. 【期刊名称】《西北农业学报》
【年(卷),期】2013(022)011
【总页数】网络分配器6页(P202-207)
【关键词】粪肠球菌;耐受性;益生性
管式直线电机【作 者】鲍延娥;董晓芳;佟建明;高玉鹏;刘炎
【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193
【正文语种】中 文
【中图分类】S816.7
益生菌来源于希腊语“益生”［1］，是一种通过调节肠道微生物菌平衡来对宿主产生有益作用的饲用微生物［2］。近年来，益生菌在动物生产中的应用越来越受到重视，其具有改善动物肠道微生物平衡，提高免疫力，调节脂肪代谢，促进动物生产以及改善畜舍环境等功能［3－5］。粪肠球菌（Enterococcus faecalis）为国家允许饲用的饲用微生物添加剂之一，是属于肠球菌属的一种兼性厌氧型乳酸菌，对环境适应力和抵抗力强，可耐受四环
素、卡那霉素、庆大霉素等多种抗生素，而且其生长条件要求不严格，在10～45℃都能生长，在普通营养培养基上也可生长，广泛分布于自然界中［6－7］。粪肠球菌作为一种益生菌，在医学和食品工程领域已得到广泛应用，但在畜禽使用的微生态制剂中，以粪肠球菌作为生产菌种的报道较少。为此，本试验旨在通过研究粪肠球菌的生长特点、耐酸性、耐胆盐性和抑菌性等探讨其作为益生菌的应用前景。 1 材料与方法
隔热pc板1.1 菌株及培养基
菌株来源：粪肠球菌CGMCC1.2135，购自中国科学院微生物研究所。胰胨－大豆胨液体培养基（TSB）：胰蛋白胨15g／L，大豆胨5g／L，氯化钠5g／L，pH为7.3，121℃灭菌30min。胰胨－大豆胨固体培养基（TSA）：胰蛋白胨15g／L，大豆胨5g／L，氯化钠5g／L，琼脂13g／L，pH 为7.3，121℃灭菌30min。营养肉汤培养基：蛋白胨10g／L，牛肉膏3g／L，氯化钠5g／L，pH 7.0，121℃灭菌30min。营养琼脂培养基：蛋白胨10g／L，牛 肉 膏 3g／L，氯 化 钠 5g／L，琼 脂13g／L，pH 7.0，121℃灭菌30min。伊红美蓝固体培养基（EMB）：称取37.5g伊红美蓝琼脂，溶解于1L蒸馏水中，121℃灭菌30min。指
示菌：大肠杆菌O1（C84010）和O78（C84008），购自中国兽药监察所。
1.2 菌株活化
从－20℃冰箱中取出粪肠球菌冻干菌粉，接种于装有50mL TSB培养基的三角瓶（250mL）中，37℃，160r／min培养24h。取0.5mL的培养液用生理盐水稀释至10－5、10－6和10－7稀释度时，取0.1mL涂布于TSA平板，37℃培养24h。用接种针挑取单菌落接种于装有50mL TSB培养基的三角瓶（250mL）中，37℃，160r／min培养24h，得发酵种子液。将粪肠球菌发酵液以2%的接种量接种于装有50mL TSB培养基的三角瓶（250mL）中，37℃培养16h，梯度稀释后平板计数，粪肠球菌为1010 CFU／mL，4 500r／min离心15min，去上清液，以无菌生理盐水洗涤菌体2次并进行稀释，最后得到109 CFU／mL的菌悬液。 1.3 粪肠球菌生长曲线及发酵液pH变化
将粪肠球菌发酵液以w＝2%的接种量接种于装有50mL TSB培养基的三角瓶（250mL）中，37℃，160r／min培养24h，从0h开始每2h取2个三角瓶，4℃保存。最后测定每瓶的p
H和600nm下的OD值。以时间为横坐标，OD值和pH值为纵坐标，分别绘制粪肠球菌在24h内的生长曲线。盆角齿
1.4 耐酸性
pH 2、3、4酸液的配制：w＝10%的盐酸以蒸馏水稀释，调pH 至2、3、4，每100mL酸中加入1g胃蛋白酶，充分溶解，0.2μm滤膜过滤，除菌，备用。
取粪肠球菌109 CFU／mL菌悬液1mL，加入装有9mL pH为2、3、4酸液的试管中，37℃，160r／min培养3h。每1h各取2个试管，梯度稀释后进行TSA平板计数。
1.5 耐胆盐性
质量分数为0.2%和0.3%胆盐溶液的配制：取KH2PO46.8g，溶解于500mL蒸馏水中，用体积分数为0.4%的NaOH调pH至6.8，加水至1 000mL，然后加入2g禽胆盐，充分溶解后以0.2μm滤膜过滤，除菌，即为0.2%的胆盐溶液；若加入3g禽胆盐，则为0.3%的胆盐溶液。取粪肠球菌109 CFU／mL菌悬液1mL，加入装有9mL质量分数为0.2%和0.3%胆盐的溶液，以不含胆盐的溶液为对照组，37℃，160r／min培养3h。每1h各取2个试管，梯度稀释
后进行TSA平板计数。
1.6 体外抑菌性
将活化的大肠杆菌O1、O78接种于营养肉汤培养基中，梯度稀释后进行营养琼脂平板计数，用无菌生理盐水调整菌悬液使活菌数密度为109 CFU／mL。
将粪肠球菌菌悬液（109 CFU／mL）作为A管，大肠杆菌O1作为B管，大肠杆菌O78作为C管，分别从B管和C管中各取1mL加入装有10mL营养肉汤的试管中单独培养，为对照管。然后从A管、B管和C管中各取1mL加入装有10mL营养肉汤的试管中，进行A管和B管以及A管和C管的混合培养，为试验组，37℃，160r／min培养12h，从0h开始每2h从各对照管和试验管中取出2个试管，梯度稀释后进行EMB平板计数。
2 结果与分析
2.1 粪肠球菌生长曲线及发酵液pH变化
由图1可知，在接种2h内，OD值变化较小，菌株处于生长延迟期，培养2h后，OD值几乎pvc安全阀
呈直线上升，生长进入对数期，培养8h生长达到高峰，以后没有出现下降的趋势，生长进入稳定期。这与图2中所示的随着培养时间的延长，发酵液pH的变化趋势相符，即粪肠球菌生长的前2h，发酵液pH变化较小，2～8h，pH迅速上升，8h之后，pH上升减缓，基本趋于稳定。
紫外可见漫反射光谱2.2 耐酸性
由表1可知，粪肠球菌经人工胃液中处理1h后，pH 2和pH 3处理组活菌数均极显著降低（P＜0.01），pH 4处理组活菌数虽低于对照组，但没有显著变化（P＞0.05）；随着处理时间的延长，各处理组活菌数均呈现极显著下降的趋势（P＜0.01），处理3h后pH 2处理组活菌数的常用对数值降低至5.43（2.71×105 CFU／mL），pH 3和pH 4处理组活菌数的常用对数值分别降低至7.01个（1.03×107 CFU／mL）和7.74（5.65×107 CFU／mL）。
2.3 耐胆盐性
由表2可知，粪肠球菌经质量分数为0.2%和0.3%的胆盐处理2h内，活菌数均呈现极显著降低的趋势（P＜0.01），处理3h后活菌数降低幅度减小，与处理2h后的活菌数的无显著差
异（P＞0.05），活菌数的常用对数值分别为6.16（1.46×106 CFU／mL）和 6.14（1.37×106 CFU／mL）。
图1 粪肠球菌的生长曲线Fig.1 The growth curve of E.faecalis
表1 粪肠球菌在不同pH下人工胃液中的活菌数密度的常用对数值±s）Table 1 The viable counts of E.faecalisin artificial gastric juice with different pH注：同行相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05），不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。表2同。Note：In the same row，values with the same or no letter superscripts mean no significant difference（P＞0.05），while with different lowercase letter superscripts mean significant difference（P＜0.05），and with different capital letter superscripts mean significant difference（P＜0.01）.The same as below.时间／h Time 0 1 2 3 pH 2 8.36±0.02Aa 7.28±0.01Bb 5.71±0.05Cc 5.43项目Item±0.02Cc±0.01Dd pH 3 8.36±0.02Aa 8.08±0.02Bb 7.38±0.01Cc 7.01±0.04Dd pH 4 8.36±0.02Aa 8.31±0.01Aa 7.92±0.04Bb 7.74
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