目的：体外研究黄芩苷经由TLR4信号转导途径抗ESBLs大肠埃希菌感染的作用及其机制。 方法：用临床分离ESBLs大肠埃希菌接种于单层生长的RAW264.7细胞培养板中以及用黄芩苷（25，50 mg·L-1）预处理的单层生长的RAW264.7细胞培养板中，逆转录聚合酶链反应（RT，PCR）检测培养细胞TLR4 mRNA表达的变化，免疫荧光检测TLR4蛋白表达的变化，Western blot检测NF，κB表达的变化和酶联免疫吸附（ELISA）检测培养上清中TNF-α含量的变化。
结果：ESBLs大肠埃希菌上调RAW264.7细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达，NF，κB表达量增加，培养上清中TNF-α含量升高。黄芩苷能抑制大肠埃希菌对RAW264.7细胞TLR4 mRNA和蛋白的上调作用，降低NF，κB的活化，减少TNF-α的分泌，抑制作用呈现黄芩苷剂量依赖性。
人造脂肪结论：黄芩苷对ESBLs大肠埃希菌体外直接抑菌作用虽然较弱，但可通过抑制TLR4及其介导的信号转导途径减少炎性因子的生成，从而发挥抗炎作用。
标签：黄芩苷；TLR4；ESBLs大肠埃希菌；信号转导途径
黄芩苷是从清热解毒类中药黄芩的根中提取的黄酮类物质，是黄芩发挥药效最重要的成分[1]。研究表明黄芩苷在体外有一定抗大肠埃希菌作用[2，3]，但作用不是很强，而在体内的抗大肠埃希菌作用较强。大肠埃希菌是临床腹泻、泌尿系感染、败血症等疾病的重要病原体，更是院内感染重要病原体之一。近年来随着抗生素的滥用，世界各地不断报道出现产超广谱β-内酰胺酶（extended，spectrumβ-lactamases， ESBLs）血清型大肠埃希菌，该类细菌对常用抗生素高度耐药，因此从中药中寻和研发新型抗菌药物成为必然。Toll样受体（Toll，like receptors，TLRs）是抗病原微生物免疫防御反应中起重要作用的受体蛋白，细菌、病毒和环境中不同病原体的相关模式分子（pathogen，associated pattern molecules，PAMPs）是其配体，两者识别结合后激活细胞信号转导途径，启动天然免疫和调节性免疫反应[4，5]，并在联系天然免疫和适应性免疫中起桥梁作用。TLR4是革兰阴性菌及其脂多糖（LPS）的主要受体，在细菌感染的极早期其介导的信号转导途径即被激活，在革兰阴性菌感染的炎症反应中起重要作用。本研究通过观察黄芩苷对ESBLs大肠埃希菌干预后小鼠巨噬细胞（RAW264.7）的TLR4 mRNA和蛋白的表达、核转录因子NF，κB蛋白活化及细胞分泌的炎性因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影響，来探讨黄芩苷抗耐
药性大肠埃希菌的机制。
1 材料
1.1 药品与试剂 黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），RT，PCR试剂盒（美国Fermentas公司），抗小鼠NF，κBp65抗体（美国Santa Cruz公司），抗小鼠TLR4，FITC抗体（美国Santa Cruz公司），引物合成（上海生工生物工程技术服务有限公司），小鼠TNF-αELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
1.2 菌株 临床分离ESBLs大肠埃希菌（安徽医科大学附属医院检验科），质控菌株：大肠埃希菌标准株ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603。
1.3 细胞 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞由安徽医科大学临床药理研究所保存。
2 方法
2.1 细胞培养与分组 将RAW264.7细胞接种于12孔细胞培养板中，待细胞生长至80%满时，
PBS洗涤2次，更换细胞维持液，按以下分组进行干预实验：细菌感染组，每孔加入ESBLs Escherichia coli终浓度1×104CFU/mL，设置正常对照；黄芩苷干预组分为25，50 mg·L-12个组，先用黄芩苷孵育1 h后，再加入细菌感染，设置黄芩苷对照；每孔设复孔4个，每组均设黄芩苷药物对照。于感染4，8，12，16，24 h后收集细胞，于感染12，24，36，48 h后收集培养上清。
2.2 RT，PCR检测细胞TLR4 mRNA表达的变化 用Trizol提取细胞总RNA，以β-actin为内参，按试剂盒说明书完成RT，PCR。TLR4引物序列上游5′，GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT，3′；下游5′，ATGGGTTTAGGCGCAGAGTT，3′，扩增片段356 bp。β-actin引物序列上游：5′，GTGGGCCGCTCTAGGC ACCAA，3′ ； 下游：5′，CTCTTTGATGTCACGCA CGATTTC，3′ ，扩增片段540 bp。凝胶成像分析仪扫描，TLR4条带与β-actin条带灰度值比值表示TLR4 mRNA的相对表达量。
2.3 直接免疫荧光法检测TLR4蛋白表达的变化 在细胞培养时，于孔板中加入细胞爬片，于感染时间点后取出爬片；用0.01 mol·L-1，pH 7.4的PBS滴于爬片上，10 min后弃去；滴加1∶8稀释的抗TLR4，FITC抗体，37 ℃孵育30 min，0.01 mol·L-1，pH 7.4 PBS洗涤3次；
压力检测装置滴加DAPI应用液，湿盒中避光室温下作用15 min，0.01 mol·L-1，pH 7.4 PBS洗涤3次；取出爬片反盖于清洁载玻片上，加缓冲甘油，荧光显微镜下观察。
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2.4 Western blot检测NF，κB表达的变化 提取细胞总蛋白，β-actin 作为内参。Western blot按照《分子克隆实验指南》进行。2.5 ELISA检测细胞培养上清中TNF-α含量的变化 操作按ELISA试剂盒说明书完成。
2.6 统计学方法 所有数据均以±s表示，采用SPSS 15.0统计软件对实验结果进行重复测量设计的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著性。羊毛纸
3 结果
3.1 黄芩苷对TLR4 mRNA表达的影响 RT，PCR显示RAW264.7细胞有一定TLR4基础表达。ESBLs大肠埃希菌可诱导RAW264.7细胞TLR4 mRNA表达上调，且上调具有时间依赖性。接种ESBLs大肠埃希菌4 h后RAW264.7细胞的TLR4 mRNA表达量开始上升，16 h升高明显， 24 h达到高峰，与基础表达量相比较上升6倍多（P＜0.01），差异具有显著性。黄芩苷可抑制TLR4 mRNA的表达， 25 mg·L-1黄芩苷TLR4 mRNA表达降低，与未加药感
染组比较P＜0.05， 50 mg·L-1黄芩苷组TLR4 mRNA表达量和基础表达量相当，与未加药感染组比较P＜0.01，与25 mg·L-1黄芩苷组比较P＜0.05。黄芩苷对TLR4基因表达的抑制作用显示出剂量依赖性（图1）。
3.2 黄芩苷对TLR4蛋白表达的影响 免疫荧光显微镜下TLR4蛋白呈现绿荧光，细胞核呈现蓝光。免疫荧光检测显示， ESBLs大肠埃希菌能上调RAW264.7细胞TLR4蛋白，其表达量随着感染时间延长逐渐增加（图2）。黄芩苷可以抑制这种上调作用，并表现出剂量依赖性，25 mg·L-1黄芩苷组TLR4表达量较感染组下降（图3），而50 mg·L-1黄芩苷组TLR4表达量降至与正常细胞TLR4蛋白水平相当（图4）。
3.3 黄芩苷对NF，κB的影响 ESBLs大肠埃希菌促进RAW264.7细胞NF，κB的活化，使得NF，κB的表达增加。黄芩苷可降低大肠埃希菌对NF，κB的活化，且这种效应表现出黄芩苷剂量依赖性。25 mg·L-1黄芩苷组NF，κB活化量较感染组下降， 50 mg·L-1黄芩苷组NF，κB表达量和正常细胞的NF，κB表达量基本一致（图5）。
3.4 黄芩苷对RAW264.7细胞培养上清中TNF-α含量的影响 ESBLs大肠埃希菌可使细胞培养上清中TNF-α含量升高，其含量随细菌感染时间延长逐渐增加。与正常对照相比，24 h离心喷雾干燥塔
后TNF-α含量显著上升（P＜0.01）。48 h 后TNF-α含量可达高峰，黄芩苷可降低TNF-α的分泌，低剂量黄芩苷组较感染组细胞培养上清中TNF-α含量有下降趋势，高剂量黄芩苷组较感染组细胞培养上清中TNF-α含量下降显著（P＜0.01）， TNF-α的下降呈現出黄芩苷剂量依赖性（表1）。
4 讨论
大肠埃希菌是院内感染的重要病原菌，其临床标本分离率占首位。由于抗生素的不规范使用和滥用，使耐药现象日趋严重，多重耐药大肠埃希菌分离率越来越高[6，8 ]。黄芩具有消炎抗菌、抗病毒、抑制变态反应、抗氧化等作用。其主要药效成分为黄芩苷，本实验主要研究黄芩苷抗ESBLs大肠埃希菌的机制。有研究表明黄芩苷在体外的直接抑菌作用较弱，但在体内则有很好的抗大肠埃希菌作用。某些中药或有效成分虽然体外直接抗菌作用不及抗生素，但可以在体内通过调整免疫炎症反应而发挥间接抗菌消炎作用。因此，推测黄芩苷也可能存在此类作用。
巨噬细胞几乎表达所有已发现的TLRs。当TLRs识别相应的PAMPs后，两者相结合激活信号转导途径，导致促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子、趋化因子、抗原提呈分子和共刺激
分子等免疫防御基因的活化表达，引起免疫炎症反应，清除病原微生物[9，11]。TLR4是Medzhitov[12]等发现的第1个Toll样受体家族成员。细菌感染的极早期TLR4即可识别相应配体而被激活后经由髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88） 依赖性和非依赖性2种途径引发NF，κB的早期相和晚期相活化，导致多种炎性因子如TNF-α，IL，1，IL，6，IL，8等的转录、翻译和释放。其中TNF-α又可诱导IL，1，IL，6和IL，8的生成，还可刺激巨噬细胞、白细胞，促进血小板激活因子、前列腺素、白三烯等产生，它们相互作用产生级联反应，导致炎性介质过度释放，造成组织器官病理性免疫损伤，产生全身炎症反应综合征[13，15]。本实验发现ESBLs大肠埃希菌能上调RAW 264.7巨噬细胞TLR4的表达，激活TLR4信号转导途径，促进核转录因子NF，κB活化，引起下游炎性因子TNF-α的分泌量显著增加。而黄芩苷则可以下调TLR4基因和蛋白的表达，抑制大肠埃希菌感染后TLR4介导的信号转导通路，使得核转录因子NF，κB的活化减少，下游炎性因子TNF-α的分泌降低，而且黄芩苷对TLR4信号转导途径的这种抑制作用呈现剂量依赖性。说明黄芩苷可能是通过抑制TLR4介导的信号转导通路来降低炎症反应。黄芩苷对大肠埃希菌的直接抑菌作用虽然不强，但能通过调节免疫系统来抑制TLR4介导的信号转导通路来减轻大肠埃希菌引起的炎症反应。当药物可以通过调节免疫系统来改变机体对病原菌的反应时，
即可避免由病原菌适应性进化导致的耐药性，这将为研发新型抗感染药物提供新的思路和方向。中药的药效成分复杂，作用靶点多，其抗感染作用机制往往不是单一的，深入研究中药抗感染机制对研发新型抗感染药物具有重要意义。
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