ESBLs筛选方法

ESBLs菌株的检测方法：

目前检测ESBLs的常用方法有双纸片协同试验（即阿莫西林双纸片协同试验与替卡西林双纸片协同试验，以NCCLS纸片表型确证试验测定结果为标准，筛选出产ESBLs）、纸片表型确证试验、琼脂稀释法确证实验、三维试验等。

一、纸片扩散法检测ESBL

1.筛选试验:

选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松(每片含量均为30μg)药敏纸片中的至少2种,用苗勒-欣顿(MHA)琼脂,标准纸片扩散法测试抑菌环直径,按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)1997年标准进行判断。凡头孢泊肟或头孢他啶的抑菌环直径≤22mm,头孢曲松≤25mm,氨曲南或头孢噻肟≤27mm,均应高度怀疑为ESBLs菌株,应进一步作确认试验来加以确诊。

2.确认试验:

用头孢他啶(每片30μg)和头孢他啶加克拉维酸(30μg和10μg);头孢噻肟(每片30μg)和头孢噻肟加克拉维酸(30μg和10μg);分别测量2种纸片单独及加克拉维酸的抑菌环直径。加克拉维酸和不加克拉维酸的抑菌环直径≥5mm可确认为ESBLs菌株。

质控菌株:

大肠埃希菌ATCC25922(头孢他啶:头孢他晓+克拉维酸≤2mm;

肺炎克雷伯菌ATCC700603(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸≥5mm)。

二、检测ESBLs最低抑菌浓度(MIC)

1.筛选试验:

选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少2种以上用阳离子增强的MH肉汤(标准肉汤稀释法)稀释至1mg/L,凡被测菌在上述各管中能够生长(MIC≥2μg/ml),均应高度怀疑为ESBLs,应进一步作确认试验来加以确诊。

2.确认试验:

用标准肉汤稀释法测定MIC的方法,按NCCLS(1997)推荐的筛选和确认ESBLs的标准进行判断。选用头孢噻肟单独稀释(范围0.25~64mg/L)及头孢噻肟(稀释范围相同)加克拉维酸(每管4mg/L);头孢他啶单独稀释(范围0.25~128mg/L)及头孢他啶加克拉维酸便携式设备(每管4mg/L),上述2种药物必须同时进行试验,结果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值如≥8倍(3个稀释度),可确认为ESBLs菌株。

质控菌株:

大肠埃希菌ATTC25922(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸<8倍);

肺炎克雷伯菌ATCC700603(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸≥8倍)。

防伪打印机三、用于ESBLs筛选的特殊试验

1.在MicroScan的一些药敏试剂条中包括了头孢泊肟、头孢他啶或氨曲南,且每种试剂条均有2种指示药物,当被试菌对这些指示药物的MIC≥2mg/L时,即可筛选出可疑的ESBLs菌株,符合NCCLS(1999)推荐的筛选药物组合及浓度范围,可用于ESBLs的筛选。

2.用浓度梯度法(Etest法)的常规试条中的三代头孢菌素或氨曲南(2种以上),凡MIC≥2mg/L时,即高度怀疑为ESBLs,应进一步作确认试验来加以确诊。现有2纸浆模具种Etest法的ESBLs确认试条,分别是头孢噻肟及头孢噻肟加克拉维酸、头孢他啶及头孢他啶加克拉维酸。检测结果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值≥8倍（3个稀释度）,可确认为ESBLs菌株。

Etest检测ESBLs的具体操作步骤是

(1)在常规试验中选出对三代头孢MIC≥1mg/L的菌株(比NCCLS的标准低一个稀释度);

(2)按NCCLS(1999)推荐的方法防喷盒,用2种底物筛选和确认ESBLs(筛选试验:在头孢噻肟或头孢曲松中1种,头孢他啶或氨曲南中选1种.

确认试验:ktkp-073用头孢噻肟和头孢他啶);

(3)确认该菌对头孢西丁的MIC≤8mg/L,以排除质粒AmpC酶;

(4)再测定该菌对其他非β内酰胺抗生素的药敏模式,以指导抗菌或收集流行病学资料。

四、其他检测方法(非NCCLS推荐的方法)

1.双纸片扩散法:

药敏平板和菌液的制备方法与常规药物敏感试验相同将菌液涂布在，MH琼脂平板上,贴上药敏纸片,1张为三代头孢菌素(头孢他啶、头孢噻肟或头孢曲松)或氨曲南,1兔子全自动设备张为含有β内酰胺酶抑制剂(克拉维酸10mg/L)的纸片,两纸片相距20~30mm(中心-中心),35℃孵育18~24小时,观察结果。如显示协同为阳性。

2.三相扩散法:

该法又有直接法和间接法2种。直接三相扩散法是在纸片扩散法的基础上略加改动,首先按标准纸片扩散法进行操作,贴上药敏纸片,在离纸片3mm处打一个小孔(靠近平板中央一侧),内加200μl浓度为105~106的菌液,35℃孵育过夜,如在头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松或氨曲南周围的抑菌圈形状发生改变,试验为阳性。如果在上述抗生素周围的抑菌圈很小或没有抑菌环,应该用间接法重复。间接三相扩散法与直接法不同在于,直接法平板表面涂布的细菌和小孔内的细菌是相同菌,而间接法平板表面涂布的细菌是用已知对上述药物均敏感的菌株如大肠埃希菌ATCC25922,小孔内为试验菌。如出现试验菌孔干扰敏感菌株形成抑菌环的现象即判断为阳性。该试验的优点在于可以同时了解细菌对抗生素的敏感情况和产ESBLs

的情况,但需要有经验的人员来判断结果。