双脱氧链终止法又称为Sanger法
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自
的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种 DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5h内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四荧光标记法，每个毛细管长3.5cM，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列 自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
杂交测序技术 杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列
序检测速度快, 采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具
有部分第二代测序技术的特点。但 该方法误差较大, 且不能重复测定
焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等。塑料水嘴
1 焦磷酸测序技术的原理及步骤
电镀马赛克焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(1ueiferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS）和荧光素水利u型槽成型机。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与反应中掺人的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。在实验过程中用a-硫化的三磷酸腺苷(dATPotS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利 用，而不被虫
荧光素识别。由于SpdATPetS可以降低dATPotS降解产物的浓度，近年来，单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein，SSBP)和纯化Spisomer dATPaS的使用dATPotS降解产物抑制双磷酸酶活性的这一问题得到较好解决，使得测序长度可达100 bp，拓展了该技术在遗
罗氏454的GS FLX测序技术利用了焦磷酸测序原理，主要包括以下步骤：
1）文库准备 将基因组DNA打碎成300-800 bp长的片段 ( 若是sn RNA 或 PCR 产物可以直接进入下一步 ) ，在单链DN A的3’端和5’端分别连上不同的接头。
2）连接 带接头的单链 DNA 被固定在DNA 捕获磁珠上。每一个磁珠携带一个单链 DNA片段。随后扩增试剂将磁珠乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了许多只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
3）扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增 (乳液PCR)，从而排除了其它序列的竞争。整个DNA片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增产生几百
万个相同的拷贝。乳液 PC R 终止后，扩增的片段仍然结合在磁珠上。
4）测序 携带D NA 的捕获磁珠被放入PTP板中进行测序。 PTP 孔的直径 ( 29 μm ) 只能容纳一个磁珠 ( 20 μm ) 。放置在 4个单独的试剂瓶里的 4种碱基，依照 T、A、C、G的顺序 依次循环进入 PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对, 就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP 硫酸化酶和荧光素酶的作用下，释放出光信号，并实时地被仪器配置的高灵敏度 CCD 捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准 确、快速地确定待测模板的碱基序列
与其它第二代测序平台相比，454 测序法的突出优势是较长的读长， 目前GS FLX测序系统的序列读长已超过400 bp 。虽然454平台的测序成本比其他新一代测序 平台 要高很多，但对于那些需要长读长的应 用，如 从头测 序，它仍是最理想的选择。
Solexa测序技术
Illumna公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序 (Sequencing by Synthesis)的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。Genome Analyzer技术的基本原理是将基因组DN A 打碎成约100-200个碱基的小片段，在片段的两个末端加上接头 ( adapter )。将DNA片段变成单链后通过接头与芯片表面的引物碱基互补
而使一端被固定在芯片上。另外一端随机和附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成桥状结构。通过30轮扩增反应，每个单分子被扩增大约1 000 倍，成为单克隆的 DNA簇，随后将DNA 簇线性化。在下一步合成反应中，加入改造过的 DNA聚合酶和带有4simdo种荧光标记的d NTP。在DNA 合成时，每一个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐，激发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫描反应板表面，在读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类后，将这些荧光基团化学切割，恢复3’端黏性，随后添加第二个核苷酸。如此重复直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果， 就可以得知每个模板DN A 片段的序列
Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng ，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2×50 bp ，每次运行后可获得超过s60220 G B的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。
SOLiD 测序技术
SOLiD 全称为Supported Oligo Ligation Detetion ，是 ABI（应用生物系统）公司于2007年底推出的全新测序技术，目前已发展到SOLiD 3 Plus。与454和 Solexa的合成测序不同，
S OLiD 是通过连接反应进行测序的。其基本原理是以四荧光标记的寡核苷酸进行多次连接
合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：
1）文库准备 SOLiD 系统能支持两种测序模板：片段文库 ( fragment library )或配对末端文库( mate-paired library) 。片段文库就是将基因组DNA打断，两头加上接头，制成文库。该文库适用于转录组测序、RNA定量、mi RNA研究、重测序、3’ ，5’_RACE 、甲基化分析及 ChIP 测序等。配对末端文库是将基因组 D NA 打断后，与中间接头连接，环化，然后用 EcoP15 酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，最后加上两端的接头，形成文库。该文库适用于全基因组测序、SNP 分析、结构重排及拷贝数分析等。
2）扩增 SOLiD用的是与 454 技术类似的乳液红外多点触摸屏 PCR 对要测序的片段进行扩增。在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、 微珠和引物，进行乳液PCR ( emulsion PCR ) 。 PCR反应结束后，磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同一DNA模板的扩增产物。
3）微珠与玻片连接 乳液PCR 完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，微珠上的
模板经过3’修饰，可以与玻片共价结合。 SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。含有 DNA 模板的磁珠共价结合在SOLiD玻片表面，SOLiD测序反应就在SOLiD玻片表面进行。每个磁珠经SOLiD测序后得到一条序列。
4）连接测序 SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。探针的5’端用4种颜的荧光标记，探针3’端第1、2 位碱基是 ATCG 4种碱基中的任何两种碱基组成的碱基对，共 16 种碱基对，因此每种颜对应着4种碱基对。 3 - 5 位是随机的3个碱基。6 - 8 位是可以和任何碱基配对的特殊碱基。单向SOLiD测序包括5轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应, 得到原始颜序列。SOLiD序列分析软件根据“双碱基编码矩阵”把碱
基序列转换成颜编码序列，然后与 SOLiD原始颜序列进行比较。由于双碱基编码规则中一种颜对应4种碱基对，前面碱基对的第二个碱基是后面碱基对的第一个碱基, 所以一个错误颜编码就会引起连锁的解码错误，改变错误颜编码之后的所有碱基。SOLiD序列分析软件可以对测序错误进行自动校正，最后解码成原始序列。因为SOLiD系统采用了双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误，提供内在
的校对功能，得到的原始碱基数据的准确度大于99.94 %，而在 15X 覆盖率时的准确度可以 达到99.99 9 % ，是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。
超高通量是 SOLiD系统最突出的 特点，目前SOLiD3单次运行可产生 50 GB 的序列数据, 相当于17倍人类基因组覆盖度。
第二代测序技术的应用
1）从头测序 ( de-novo sequencing) 对于基因组未被测序过的生物，其基因组测序需要从头测序。由于受测序读取长度的限制，新一代测序技术中只有454技术能独立完成复杂基因组如真核生物基因组的从头测序工作。 Solexa和 SOLiD技术只能完成简单生物如细菌的基因组的从头测序。在复杂基因组的从头测序中，将Sol xa /S O L i D 与 45 4 技术或传统的Sanger测序技术结合，分别利用它们的高通量和较长读长的优势，可以大大降低测序成本，提高测序速度。
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