一种索法酮小分子活性探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种索法酮小分子活性探针，属于药物化学技术领域。

背景技术：

2.索法酮(sofalcone)又名苏法抗，是在传统植物药广豆根中分离得到的一种化合物，化学名为(e)
ꢀ‑
2-［5-( 3-甲基-2-丁烯氧基)
ꢀ‑
2-［3-［4-( 3-甲基-2-丁烯氧基)］苯基］丙烯酰基］乙酸(ⅰ)。
3.索法酮是我国目前唯一批准上市的胃炎和胃溃疡的前列腺素分解酶抑制剂类药物，具有增加前列腺素e2含量、促进胃黏膜修复、抗溃疡等药理作用。通过抑制15-羟基前列腺素脱氢酶，增加胃组织内前列腺素e2含量，在保护胃黏膜方面起重要作用；对胃溃疡、十二指肠溃疡及慢性胃炎具有较好的效果；可以抑制pylori菌株活性，导致pylori变形，抑制h.pylori对胃黏膜的黏附，抑制脂肪分解，且长期使用的安全性已经在临床上得到证实。
4.尽管目前索法酮作为一类安全有效的药物，索法酮及其衍生物在多方面发挥重要作用，但其在体内具体的蛋白靶点以及作用机制尚不清楚。

技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，本发明提供了一种索法酮小分子活性探针，其可作为生物正交标记探针，用于靶点蛋白的确定并探究索法酮及其衍生物的药理机制，其还具有抗炎等活性，可用作制备相应药物。
6.为了实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：本发明第一方面的技术目的是提供一种索法酮小分子活性探针，其是具有式ⅰ所示结构的化合物：ⅰ其中，n为0-6的整数。
7.作为进一步的优选，n为1，2，3或4。
8.本发明第二方面的技术目的是提供一种索法酮小分子活性探针的制备方法，包括以下内容：将索法酮和炔基胺加入至溶剂中，在缩合剂和碱性试剂存在条件下反应，得到所述索法酮小分子活性探针；所述炔基胺是具有式ⅱ所示结构的化合物：
ⅱ
其中，n为0-6的整数。
9.进一步的，作为优选，n为1，2，3或4。
10.进一步的，上述反应中，索法酮和炔基胺的摩尔比为1：0.8-5，进一步优选的摩尔比是1:1-3。
11.进一步的，上述反应的时间为12-72h，反应温度为0-60℃，优选20-50℃。
12.进一步的，所述溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、二甲基亚砜（dmso）、二氯甲烷（ch2cl2）、和二甲亚砜中的至少一种。
13.进一步的，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edci）、1-羟基苯并三唑（hobt）、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯（hatu）、二环已基碳二亚胺（dcc）、二异丙基碳二亚胺（dic）、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（hctu）和4-二甲氨基吡啶（dmap）中的至少一种。更优选的，所述缩合剂为以下两种溶剂的组合：edci和hobt。
14.进一步的，所述缩合剂按缩合剂与索法酮的摩尔比为0.5-10：1，优选1.5-8:1加入。
15.进一步的，所述碱性试剂选自n,n-二异丙基乙胺（dipea）、n,n-二乙基乙胺（tea）、叔丁醇钾、叔丁醇钠、氢化钠、氢化钾、吡啶、二氮杂二环（dbu）、乙醇钠，甲醇钠，碳酸氢钠和碳酸钠中的至少一种。
16.进一步的，所述碱性试剂按碱性试剂与索法酮的摩尔比为0.5-6：1加入。
17.进一步的，上述制备方法还包括从反应后溶液中分离和纯化索法酮小分子活性探针的步骤，具体是：向反应后的溶液依次加入水和有机萃取剂，多次萃取后合并有机相，浓缩，柱层析得白晶体，为所述索法酮小分子活性探针。
18.进一步的，所述有机萃取剂为乙酸乙酯、石油醚或乙醚等有机溶剂。
19.进一步的，柱层析时所使用的展开剂选自石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇中的至少一种。优选的，所述展开剂选自以下两种或三种溶剂的组合：石油醚和乙酸乙酯，二氯甲烷和甲醇，石油醚、乙酸乙酯和甲醇。
20.本发明第三方面的技术目的是提供所述索法酮小分子活性探针作为索法酮标记探针的应用。
21.所述索法酮小分子活性探针作为索法酮的标记探针，用于研究索法酮的药理作用机理。具体的，是研究索法酮抗炎、抗菌等方面的药理机制。
22.本发明第四方面的技术目的是提供所述索法酮小分子活性探针在制备抗炎和/或抗菌药物中的应用。其中，具体是在制备胃炎或胃溃疡药物中的应用，及在制备抗金黄葡萄球菌药物中的应用。
23.实施本发明实施例，将具有如下有益效果：（1）本发明的索法酮小分子活性探针可作为生物正交标记探针，尤其是用于标记索法酮，用于研究索法酮抗炎、抑菌等方面的药理机制，探究索法酮的蛋白作用靶点，有助
j = 3.2, 1.4 hz, 2h), 4.49 (t, j = 7.6 hz, 4h), 3.94 (dd, j = 5.4, 2.4 hz, 2h), 2.08 (t, j = 2.4 hz, 1h), 1.74 (d, j = 4.8 hz, 6h), 1.69 (d, j = 6.4 hz, 6h).其核磁图如图1所示。
34.实施例21）将0.2mmol索法酮和0.3mmol 1-氨基-3-丁炔溶于dmf中，加入0.3 mmol hatu和0.3 mmol dipea，在40℃下反应24h，得到混合液。
35.2）向1）中混合液中加入少量水，用8ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机层。
36.3）将有机相浓缩，柱层析（二氯甲烷：甲醇=8:1）得白晶体，产率为70%。
37.实施例31）将0.3 mmol索法酮和0.4mmol 1-氨基-4-戊炔溶于dmf中，加入0.9mmol hatu和0.9mmol dipea，在50℃下反应36h，得到混合液。
38.2）向1）中混合液中加入少量水，用8ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机层。
39.3）将有机相浓缩，柱层析（二氯甲烷：甲醇=6:1）得白晶体，产率为72%。
40.实施例41）将0.1mmol索法酮和0.3mmol 1-氨基-3-丁炔溶于dmf中，加入0.3mmol hatu和0.3mmol dipea，在20℃下反应48 h，得到混合液。
41.2）向1）中混合液中加入少量水，用4ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。
42.3）将有机相浓缩，柱层析（二氯甲烷：甲醇=15:1）得白晶体，产率为60%。
43.实施例51）将0.15mmol索法酮和0.3mmol 1-氨基-2-丙炔溶于4mlch2cl2中，加入0.6mmol edci和0.6mmol hobt，碱性试剂0.45mmol dipea，在25℃下反应72h，得到混合液。
44.2）向1）中混合液中加入少量水，用10ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。
45.3）将有机相浓缩，柱层析（二氯甲烷：甲醇=10:1）得白晶体，产率为65%。
46.实施例61）将0.3mmol索法酮和0.6mmol 1-氨基-5-己炔溶于ch2cl2中，加入0.9mmol edci和0.9mmol hobt，碱性试剂0.9mmol dipea，在50℃下反应48h，得到混合液。
47.2）向1）中混合液中加入少量水，用12ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。
48.3）将有机相浓缩，柱层析（二氯甲烷：甲醇=6:1）得白晶体，产率为70%。
49.以下实施例7-9中使用的索法酮探针为实施例1制备的产物。
50.实施例7在本实施例中测定了索法酮小分子活性探针的体外抗菌最低抑菌浓度（mic），使用的菌种为金黄葡萄球菌。
51.将菌液取50 μl加入700 μl的lb液体培养基中，于200 rpm/min 37℃全温振荡器中培养至od600达0.8，备用。取无菌96孔板，往b-g排1-12号孔中加入100 μl液体培lb养基，再往 b-g 排2号孔加入97.44 μllb培养基和2.56μl药物原液（孔内药物浓度为 128 μg/ml），b-g排2-11号孔依次进行药物倍比稀释，每孔药物浓度分别为128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml。然后往 b-g 排1-11号孔添加1μl 菌液。设置 b-g排的1号孔为阴性对照，只添加菌液不添加药物，设
置b-g排的12号孔为空白对照，不添加菌液和药物。最后放置于37℃恒温培养箱中孵育16 h后，通过肉眼和多功能酶标仪测定od600值得出结果。不同药物浓度对应的菌种抑菌率见图2；与阴性对照组od值无显著性差异的孔所含最低抗菌化合物浓度即为最小抑菌浓度，mic
50
和mic
90
结果见表1。
52.表1实施例8在本实施例中进行了索法酮小分子活性探针结合金黄葡萄球菌蛋白强度与特异性探索：1）摇菌一夜至细胞进入静止期1h内，收菌，低温(4℃) 8000 rpm离心10 min，之后用pbs清洗一遍，去pbs，加入pbs重悬菌体，取100μl加入新的ep管内，分别标记为0 μm、1 μm、5 μm、10 μm、25 μm、50 μm。
53.2）索法酮探针溶液准备：称取索法酮探针，加入dmso配制成100mm的母液备用。再使用dmso将索法酮探针母液稀释成浓度梯度为5 mm、2.5 mm、1 mm、0.5 mm、0.1 mm、0 mm的溶液备用。
54.3）ep管中分别加入1μl上述浓度梯度的索法酮探针溶液，此时体系中药物探针浓度分别为50 μm、25 μm、10 μm、5 μm、1 μm、0 μm涡旋混匀后瞬时离心数秒，室温500 rpm/min孵育12h。
55.4）12 h后，低温(4℃) 8000 rpm离心5 min，pbs清洗三遍，去pbs，每管ep管加入200 μl细菌裂解液，在涡旋振荡器上震荡30sec,让菌体充分悬浮，室温下放在摇床上轻轻震荡2h，或将ep管放入冰箱或液氮中反复冻融，低温(4℃) 12000 rpm离心5min，取上清用于后续实验。
56.5）click工作液配制：将细菌蛋白溶液用bca法定量，使用细菌裂解液稀释至1.6mg/ml。每100 ul的反应体系加入6 μl1x tbta（1.7 mm）, 2 μl 50 mm cuso4，0.6μl 10 mm rhodmine-n3和2 μltcep (浓度为14.4 mg/ml，50 mm现用现配）混合后，吸取12 μl迅速分别加到每个样品中，混匀涡旋离心后在29℃下反应4 h；6）丙酮沉淀：click反应结束后向每个样品管中加入1 ml 冰丙酮来沉淀蛋白（丙酮提前放到-20℃），-20℃静置 20-30 min或者-20℃过夜。将冰浴的样品管在 12000 rpm（或最高转速），4℃，离心10 min，弃去上清丙酮；7）超声复溶及跑胶：向每个样品管中加入 30 μl 1 x loading buffer，水浴超声；超声后将样品管置于95℃条件下煮样5 min后拿出轻微振荡，再煮5 min，共计10 min。每个样品取20 μl上样跑sds-page胶，随后荧光成像。用考马斯亮蓝染胶，然后漂洗，洗过的胶观察蛋白总量。
57.结果表明，所合成的索法酮探针可结合标记细菌蛋白，且效果呈剂量依赖性。进一步说明索法酮探针可以作为抗炎药物。
58.实施例9
在本实施例为在金黄葡萄球菌活菌内索法酮小分子活性探针和索法酮的原位竞争实验：1）摇菌一夜至细胞进入静止期1 h内，收菌，低温(4℃) 8000 rpm离心10 min，之后用pbs清洗一遍，去pbs，加入pbs重悬菌体，取1ml加入新的ep管内，分别标记为空白组、探针组、1:10。
59.2）索法酮原药准备：称取索法酮原药，加入dmso配制成100mm的母液备用。1:10组ep管中加入2.5 μl索法酮原药溶液，此时体系中药物浓度分别为250 μm，涡旋混匀后瞬时离心数秒，室温，500 rpm/min孵育4h。
60.3）索法酮探针溶液准备：称取索法酮探针，加入dmso配制成100mm的母液备用。再使用dmso将索法酮母液稀释成浓度为25 mm的溶液备用。
61.4）在探针组、1:10组ep管中分别加入1 μl上述浓度梯度的索法酮探针溶液，此时体系中药物探针浓度分别为25 μm，涡旋混匀后瞬时离心数秒，室温，500 rpm/min孵育 8 h；8h后，低温(4℃) 8000 rpm离心5min，pbs清洗三遍，去pbs，每管ep管加入200 μl细菌裂解液，在涡旋振荡器上震荡30sec,让菌体充分悬浮，室温下放在摇床上轻轻震荡1h，超声裂解，低温(4℃) 12000 rpm离心5min，取上清用于后续实验。
62.5）蛋白定量：将细菌蛋白溶液用bca法定量，使用细菌裂解液稀释至2mg/ml。每100 ul的反应体系加入6 μl 1x tbta（1.7 mm）, 2 μl 50 mm cuso4，0.6 μl 20 mm rhodmine-n3和2 μl tcep (浓度为14.4mg/ml，50 mm现用现配）混合后，吸取13 μl迅速分别加到每个样品中，混匀涡旋离心后在29℃下反应4h;6）丙酮沉淀：click反应结束后向每个样品管中加入1 ml冰丙酮来沉淀蛋白（丙酮提前放到-20℃），-20℃静置20-30 min或者-20℃过夜。将冰浴的样品管在12000 rpm（或最高转速），4℃，离心10 min，弃去上清丙酮;7）超声复溶：向每个样品管中加入50 μl 1 x loading buffer，水浴超声;8）跑胶：超声后将样品管置于95℃条件下煮样5 min后拿出轻微振荡，再煮5 min，共计10 min。每个样品取15 μl上样跑sds-page胶，随后荧光成像。荧光下拍好照后，用考马斯亮蓝染胶，然后漂洗，洗过的胶拍照观察蛋白总量。
63.结果见图3。图3表明，实施例1制备的索法酮小分子活性探针药物可特异性结合原药索法酮所结合的蛋白，证明该药物探针与原药相比几乎无差异，可替代原药对相关蛋白靶点进行结合研究，为进一步索法酮的机制研究提供了理论基础。
64.以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

技术特征：

1.一种索法酮小分子活性探针，其特征在于，其是具有式ⅰ所示结构的化合物：ⅰ其中，n为0-6的整数。2.根据权利要求1所述的索法酮小分子活性探针，其特征在于，式ⅰ中n为1，2，3或4。3.一种索法酮小分子活性探针的制备方法，包括以下内容：将索法酮和炔基胺加入至溶剂中，在缩合剂和碱性试剂存在条件下反应，得到所述索法酮小分子活性探针；所述炔基胺是具有式ⅱ所示结构的化合物：ⅱ其中，n为0-6的整数。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，索法酮和炔基胺的摩尔比为1：0.8-5。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、和二甲亚砜中的至少一种。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、二环已基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯和4-二甲氨基吡啶中的至少一种。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱性试剂选自n,n-二异丙基乙胺、n,n-二乙基乙胺、叔丁醇钾、叔丁醇钠、氢化钠、氢化钾、吡啶、二氮杂二环、乙醇钠、甲醇钠、碳酸氢钠和碳酸钠中的至少一种。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括从反应后溶液中提取和纯化索法酮小分子活性探针的步骤。9.权利要求1所述的索法酮小分子活性探针作为索法酮标记探针的应用。10.权利要求1所述的索法酮小分子活性探针在制备抑菌、抗炎药物中的应用，抗炎药物是胃炎或胃溃疡的药物，抑菌药物是抗金黄葡萄球菌药物。

技术总结

本发明实施例公开了一种索法酮小分子活性探针，其具有下式所示结构，其中n为0-6的整数。其通过将索法酮和炔基胺加入至溶剂中，在缩合剂和碱性试剂存在条件下反应，得到所述索法酮小分子活性探针。本发明的索法酮小分子活性探针可作为生物正交标记探针，尤其是用于标记索法酮，用于研究索法酮抗炎、抑菌等方面的药理机制，探究索法酮的蛋白作用靶点，有助于深入了解索法酮的作用机制，有助于设计出更安全和高效的抗炎抗菌的索法酮衍生药物。其还具有一定的抗炎、抗菌作用，可直接用于制备抗炎、抗菌等药物。抗菌等药物。抗菌等药物。抗菌等药物。