基因I型与II型非洲猪瘟病毒鉴别检测引物及其应用

基因i型与ii型非洲猪瘟病毒鉴别检测引物及其应用
技术领域
1.本发明属于兽医诊断领域，涉及基因i型与ii型非洲猪瘟病毒鉴别检测引物及其应用。

背景技术：

2.非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，所有品种和年龄的猪均易感，且发病率和致死率可达100％，其临床特征主要表现为高热、皮肤发绀、流产以及内脏器官和淋巴结充血肿大。
3.目前尚无有效asf的药物和商品化疫苗，asf的防控关键是做好各个生产环节的生物安全防护，因此，加强asfv的检测技术研究，开发快速、灵敏、特异的诊断试剂和诊断方法具有重要意义。
4.现有asf实验室的检测方法主要分为血清学方法和病原学方法。前者主要有间接荧光抗体试验，以及间接或阻断酶联免疫吸附(elisa)试验等；后者包括病毒分离(红细胞吸附试验，ha)、直接免疫荧光试验(dif)、双抗体夹心elisa试验和asfv基因组dna检测(pcr、qpcr)等，其中 oie推荐的pcr和荧光pcr(qpcr)方法的应用最为广泛。我国《非洲猪瘟防治技术规范(试行)》中列出了双抗体夹心elisa试验、pcr和qpcr 3 种病原学检测方法。
5.asfv根据其b646l基因(编码p72蛋白)可分为24个基因型。实验证实我国流行的基因i型毒株致病力与基因ii型毒株有较大差异，其防控策略也不尽相同。因此，极有必要通过快速鉴别诊断确定场区流行的asf基因型，区分我国主要流行的基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒，有利于进行针对性防控；同时便于掌握不同asfv基因型在我国的分布以及流行趋势。
6.常规的分子诊断方法包括普通pcr、荧光定量pcr、基因芯片及恒温扩增检测技术等，普通pcr、基因芯片及恒温扩增检测技术等方法存在灵敏度低、成本高、开发技术难度大、易造成气溶胶污染等缺点，而荧光定量pcr 比其他常规分子诊断技术具有灵敏性高、特异性好、通量高、污染低等优势，其在动物疫病诊断、基因定性和定量检测等方面的应用非常广泛，已经成为当前病毒核酸快速检测的主要方法。
7.asf与猪瘟、高致病性猪蓝耳病和伪狂犬病等病毒病；猪丹毒、猪链球菌和副嗜血杆菌等细菌病；以及某些中毒和败血症等在临床和病变上相类似，因此，病原学检测鉴定方法具有十分重要的意义。目前，针对asfv的实时荧光定量pcr检测商品化试剂盒都是通用型asfv检测试剂盒，无法实现基因i型和基因ii型asfv的鉴别诊断检测，难以有效应对当前猪场asfv感染的现状和检测需求。

技术实现要素：

8.为了克服现有技术的不足，本发明发现了基因i型非洲猪瘟病毒与基因 ii型非洲猪瘟病毒特定基因组片段上的两个snps，并针对上述snps，基于变阻滞扩增系统(amplification refractory mutation system,arms)又称等位基因特异性扩增法的原理
(即如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热dna聚合酶无法延伸)，将其与qpcr方法结合，成功研发了一种用于快速鉴别诊断asfv基因i型和ii型的荧光定量pcr检测方法，即 arms-qpcr，其灵敏性与oie推荐的qpcr检测方法相当。
9.本发明第一方面提供了一种核酸组合，所述核酸组合为第一核酸组合或第二核酸组合；
10.所述第一核酸组合包括第一引物，第二引物，第三引物，第一探针和第二探针；
11.所述第二核酸组合包括第四引物，第五引物，第六引物，第三探针和第四探针；
12.其中：
13.所述第一引物下游的特异性核酸序列如seq id no.3所示；
14.所述第二引物下游的特异性核酸序列如seq id no.4所示；
15.所述第三引物下游的特异性核酸序列如seq id no.5所示；
16.所述第一探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.6所示，一端连接有第一荧光基团，另一端连接有第一淬灭基团；
17.所述第二探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.7所示，一端连接有第二荧光基团，另一端连接有第二淬灭基团；
18.所述第一淬灭基团能够淬灭所述第一荧光基团发出的荧光；
19.所述第二淬灭基团能够淬灭所述第二荧光基团发出的荧光；
20.所述第一荧光基团不能够淬灭所述第二荧光基团或所述第二淬灭基团发出的荧光；
21.所述第一淬灭基团不能够淬灭所述第二荧光基团或所述第二淬灭基团发出的荧光；
22.所述第二荧光基团不能够淬灭所述第一荧光基团或所述第一淬灭基团发出的荧光；
23.所述第二淬灭基团不能够淬灭所述第一荧光基团或所述第一淬灭基团发出的荧光；
24.所述第四引物下游的特异性核酸序列如seq id no.3所示；
25.所述第五引物下游的特异性核酸序列如seq id no.9所示；
26.所述第六引物下游的特异性核酸序列如seq id no.10所示；
27.所述第三探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.6所示，一端连接有第三荧光基团，另一端连接有第三淬灭基团；
28.所述第四探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.7所示，一端连接有第四荧光基团，另一端连接有第四淬灭基团；
29.所述第三淬灭基团能够淬灭所述第三荧光基团发出的荧光；
30.所述第四淬灭基团能够淬灭所述第四荧光基团发出的荧光；
31.所述第三荧光基团不能够淬灭所述第四荧光基团或所述第四淬灭基团发出的荧光；
32.所述第三淬灭基团不能够淬灭所述第四荧光基团或所述第四淬灭基团发出的荧光；
33.所述第四荧光基团不能够淬灭所述第三荧光基团或所述第三淬灭基团发出的荧
光；
34.所述第四淬灭基团不能够淬灭所述第三荧光基团或所述第三淬灭基团发出的荧光。
35.在一些实施方式中，所述第一探针中，5’端连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；
36.所述第二探针中，5’端连接有第二荧光基团，3’端连接有第二淬灭基团。
37.在一些实施方式中，所述第一荧光基团为cy5，所述第一淬灭基团为 bhq2，所述第二荧光基团为fam，所述第二淬灭基团为tamra；或者
38.所述第一荧光基团为fam，所述第一淬灭基团为tamra，所述第二荧光基团为cy5，所述第二淬灭基团为bhq2。
39.在一些实施方式中，所述第三探针中，5’端连接有第三荧光基团，3’端连接有第三淬灭基团；
40.所述第四探针中，5’端连接有第四荧光基团，3’端连接有第四淬灭基团。
41.在一些实施方式中，所述第三荧光基团为cy5，所述第三淬灭基团为 bhq2，所述第四荧光基团为fam，所述第四淬灭基团为tamra；或者
42.所述第三荧光基团为fam，所述第三淬灭基团为tamra，所述第四荧光基团为cy5，所述第四淬灭基团为bhq2。
43.在一些实施方式中，所述第一引物的核酸序列如seq id no.3所示；
44.所述第二引物的核酸序列如seq id no.4所示；
45.所述第三引物的核酸序列如seq id no.5所示。
46.在一些实施方式中，所述第四引物的核酸序列如seq id no.3所示；
47.所述第五引物的核酸序列如seq id no.9所示；
48.所述第六引物的核酸序列如seq id no.10所示。
49.本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第一方面所述的核酸组合。
50.本发明第三方面提供了一种非诊断目的的鉴别检测基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒的方法，所述方法为：使用本发明第一方面所述的核酸组合对从目标检测样本所提取出来的核酸进行qpcr检测。
51.在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
52.s1：提取目标检测样本的基因组模板；
53.s2：将所述基因组模板、所述第一核酸组合或第二核酸组合、qpcr反应试剂混合，得到反应体系；
54.s3：对所述反应体系进行热循环，通过荧光信号针对i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒进行鉴别检测。
55.在一些实施方式中，所述热循环中，预处理为：95℃，30s，温度循环程序为：95℃，10s，60℃，30s，循环次数为38-42。
56.本发明第四方面提供了本发明第一方面所述的核酸组合或本发明第二方面所述的试剂盒在制备鉴别检测基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒的制剂或系统中的应用。
57.本发明所述第一、第二、第三、第四、第五、第六等顺序性限定是为了区分场景，便于清楚地表达，不代表重要性的先后顺序或操作中的先后使用顺序，也不必然代表结构/组成不同。
58.本发明的核酸组合敏感性好，特异性高，能够通过qpcr对基因i型与 ii型非洲猪瘟病毒的核酸进行有效的鉴别检测。
附图说明
59.图1示出了基因i型与基因ii型asfv基因组片段序列比对结果。
60.图2示出了arms-qpcr对基因i型与ii型asfv阳性培养物的检测结果。
61.图3示出了不同浓度i型asfv阳性质粒fam通道反应结果。
62.图4示出了不同浓度i型asfv阳性质粒cy5通道反应结果。
63.图5示出了不同浓度ii型asfv阳性质粒fam通道反应结果。
64.图6示出了不同浓度ii型asfv阳性质粒cy5通道反应结果。
65.图7示出了基因i型与ii型qpcr诊断方法的特异性试验结果。
66.图2-7中，横坐标数字代表qpcr循环反应的次数。
具体实施方式
67.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
68.本发明没有说明的材料与仪器为本领域常规材料与仪器，本发明没有说明的操作细节为本领域常规操作。
69.本发明所示核酸序列均是按照5’到3’的方向从左到右书写。
70.本发明所述上游是指核酸的5’端或5’端方向，下游是指核酸的3’端或3’端方向。
71.定义
72.非诊断目的的鉴别检测基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒，是指不是以诊断为目的或结果而获得猪的感染状况，评价猪的健康状况，或评价针对猪的或预防效果而进行鉴别检测基因i型非洲猪瘟病毒与基因 ii型非洲猪瘟病毒。
73.非诊断目的操作的一种应用举例：为了新建养猪场选址，当进行环境病原体安全性评价而对多种潜在猪病原体(比如，基因i型非洲猪瘟病毒、基因ii型非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒等) 进行检测时，对于环境样本针对潜在基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒进行鉴别检测。
74.材料
75.(1)细胞与病毒
76.猪肺泡巨噬细胞(pam)、i型asfv毒株：sd/dy-i/21株(genebank 序列号：mz945537.1)和ii型asfv毒株：pig/cn/hlj/2018株(genebank 序列号：mk333180.1)，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室鉴定与保存。
77.(2)dna制备
78.利用含有基因i型和基因ii型asfv的细胞培养物、感染猪的血液、口腔和肛门拭子
保存液、脾脏、扁桃体、颌下淋巴结组织，用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒(dp315)提取病毒基因组dna。
79.(3)阳性对照
80.含有genebank序列号为mz945537.1的基因i型asfv基因组 89,416-91,356bp片段和mk333180.1的基因ii型asfv基因组103,618-105,558bp片段的阳性质粒，基础质粒为：pcaggs，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建、鉴定和保存。用于敏感性试验以及检测反应中的基因i型和基因ii型asfv阳性对照样品。
81.(4)特异性验证样品
82.猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、伪狂犬病病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、传染性胃肠炎病毒(tgev)和猪轮状病毒(porv)的核酸，由各自病毒的适应性细胞的细胞培养物中提取，其毒价均大于106tcid
50
/ml，取0.2ml，分别用 (2)所述的核酸提取试剂盒提取制备而成。
83.(5)受检样品
84.首先，用pbs稀释液分别将基因i型asfv毒株(sd/dy-i/21株)稀释至1
×
106tcid
50
/ml和基因ii型asfv毒株(pig/cn/hlj/2018株)稀释至1
ꢀ×
10
2.5
had
50
/ml，然后，分别经肌肉注射感染7-9周龄spf猪，剂量为1ml/ 头；并于感染后根据感染猪的临床表现(即i型asfv感染的猪出现坏死性皮肤损伤和关节肿胀等症状；ii型asfv感染的猪出现濒死等症状)及时进行剖检，通过常规方法采集血液、口腔和肛门拭子以及组织样品(脾脏、扁桃体、颌下淋巴结)，分别用(2)所述的核酸提取试剂盒提取制备而成基因组模板。上述基因i型和基因ii型asfv的肺泡巨噬细胞感染试验、spf猪的感染试验，均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所p3或p4实验室进行。
85.实施例1：snps的发现与引物设计
86.分别下载genebank数据库中若干基因i型和ii型asfv全基因组序列，根据序列信息选取基因i型asfv(genebank序列号：mz945537.1)的基因组89,416-91,356bp和基因ii型asfv(genebank序列号：mk333180.1)的基因组103,618-105,558bp的基因组片段序列，利用dnastar中的megalign 程序进行与各自同源序列之间的比对，部分序列比对的结果如图1所示，其中，基因i型asfv(genebank序列号：mz945537.1)的基因组89,579-89,727bp 的特异性片段(序列参加下述seq id no.1)与基因ii型asfv(genebank 序列号：mk333180.1)的基因组103,781-103,929bp的特异性片段(序列参加下述seq id no.2)在所比较的基因组片段之间存在两个snps，其他位置各同源基因组片段序列之间一致。
87.i型asfv(genebank序列号：mz945537.1)的基因组的第89,647(snp1) 和89,701(snp2)两个位点碱基分别为t和c；ii型asfv(genebank序列号：mk333180.1)的基因组第103,849(snp1)和103,903(snp2)两个位点碱基分别为c和t。
88.i型asfv特异性片段(seq id no.1)：
[0089][0090]
ii型asfv特异性片段(seq id no.2)：
[0091][0092]
由此见通过这两个snps可以对i型和ii型asfv进行鉴别检测。
[0093]
根据这两个snps位点设计引物和探针，基于等位基因特异性扩增法的原理，利用常规的引物、探针设计软件primer5筛选候选的引物与探针，再在genebank数据库中进行序列比对，以确保引物与探针的特异性和扩增效率。
[0094]
通过筛选和验证，最终得到第一套i型和ii型asfv鉴别诊断的引物和探针信息如表1所示，均由吉林省库美生物科技有限公司合成。
[0095]
表1：第一套引物、探针和扩增序列信息
[0096][0097][0098]
注：“n”代表无修饰，方框标记snp位点对应碱基。
[0099]
根据前述信息，设计第二套i型和ii型asfv鉴别诊断的引物和探针，信息如表2所示。
[0100]
表2：第二套引物、探针和扩增序列信息
[0101][0102]
注：“n”代表无修饰，方框标记snp位点对应碱基。
[0103]
本发明实施例2-4中使用的是第一套引物、探针。
[0104]
实施例2：i型和ii型asfv鉴别诊断荧光定量pcr方法的建立
[0105]
(1)样品处理
[0106]
对基因i型和ii型asfv细胞培养物、组织脏器、血液、口腔和肛门拭子，在p3实验室内，用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因组dna/rna 提取试剂盒(dp315)，提取基因组dna，取2μl作为arms-qpcr模板。
[0107]
(2)反应体系
[0108]
反应体系按25μl/管进行配制，其中含引物、探针的qpcr反应液和含 qpcr酶的扩增试剂23μl(扩增试剂按照bio-rad：cfx96配套试剂使用)，模板量2μl。扩增试剂根据“待检样本数(n)+i型和ii型asfv阳性对照(2) +阴性对照(1)+1＝应测试数n”，按照表3的比例进行配制，然后加入提取的样本模板(dna模板)2μl，同时设定阴性、阳性对照，瞬时离心后进行上机检测。
[0109]
针对含引物、探针的qpcr反应液，每个反应体系中分别含有1μl f (10pmol)、1μl i r(10pmol)、1μl ii r(10pmol)、0.5μl probe 1(5pmol)、 0.5μl probe 2(5pmol)、12.5μl 2
×
mix、6μl ddh2o。
[0110]
表3：i型与ii型qpcr反应体系配制
[0111][0112]
(3)反应条件与程序
[0113]
在荧光定量pcr仪(bio-rad：cfx96)上按照表4进行程序设定；荧光检测通道选择：fam和cy5，具体检测通道设置参照各仪器使用说明书进行操作。
[0114]
表4：程序设定参数
[0115][0116]
(4)结果判定
[0117]
(a)判定原理：反应体系中含有f、i r、ii r、probe 1(含cy5)、probe2(含fam)，当样本中含有i型asfv基因组模板时，f、i r、probe 1(含cy5)、probe 2(含fam)参与反应，fam和cy5两个通道发出荧光。当样本中含有ii型asfv基因组模板时，f、ii r、probe 2(含fam)参与反应，仅fam一个通道发出荧光。由此可见，根据qpcr反应两个荧光通道中ct 值的情况，即可判断样本中含有基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒中的哪一种。
[0118]
(b)试验结果成立的条件：i型asfv阳性对照有明显指数扩增曲线，且fam和cy5两个通道的ct值均≤32；ii型asfv阳性对照fam通道有明显指数扩增曲线，且ct值≤32，而cy5通道结果为无ct值；阴性对照检测结果为无ct值，以上均成立才可判定试验成立，否则试验无效。
[0119]
(c)结果判定标准：在试验结果成立的条件下，按表5判定标准进行结果判定；可疑样品需要进行第二次检测，第二次检测结果的ct值≤40，则判定为阳性；否则，判定为阴性。
[0120]
表5：判定标准
[0121]
[0122][0123]
(5)鉴别诊断方法的建立
[0124]
通过对基因i型和ii型asfv毒株(分别为sd/dy-i/21株和 pig/cn/hlj/2018株)感染猪肺泡巨噬细胞后提取的dna以及阴性对照样品 (无核酶水)，通过前述方法进行arms-qpcr检测，扩增曲线参见图2。结果表明，i型asfv毒株(sd/dy-i/21株)样品的fam和cy5两个荧光通道的ct值分别为21.34和19.44，且有明显的扩增曲线；ii型asfv毒株 (pig/cn/hlj/2018株)样品的fam荧光通道的ct值为20.37，且有明显的扩增曲线，而cy5荧光通道ct值为no ct，且无扩增曲线；阴性对照样品的 fam和cy5两个荧光通道的ct值均为no ct，且无扩增曲线。
[0125]
由此可知：对于i型asfv样品：fam的ct值≤40和cy5的ct值≤ 40；ii型asfv样品：fam的ct值≤40和cy5的ct值＞40；阴性对照样品：fam的ct值＞40和cy5的ct值＞40；这满足了i型和ii型asfv鉴别诊断的判定标准，完全能够将i型asfv与ii型asfv区分开，本发明设计的引物、探针与反应条件能够满足i型和ii型asfv鉴别诊断的需求。
[0126]
实施例3：敏感性试验
[0127]
(1)方法
[0128]
根据拷贝数计算公式：拷贝数/ml＝(6.02x10
23
拷贝数/摩尔)x(浓度g/ml) /(mw g/mol)，用无核酶水将i型和ii型asfv阳性质粒分别稀释至107拷贝数/2μl，然后，分别进行十倍系列稀释，稀释为每2μl含有100、101、102、 103、104、105和106模板拷贝数的样品，每个稀释度设置3个重复，同时设置阴性对照(无核酶水)。按照实施例2建立方法的反应条件在pcr仪设置程序，并进行arms-qpcr检测。
[0129]
(2)i型asfv敏感性检测
[0130]
用i型asfv阳性质粒(拷贝数107/2μl)，按照1:10、1:102、1:103、1:104、 1:105、1:106和1:107进行梯度稀释，每管拷贝数分别为1
×
106、1
×
105、1
ꢀ×
104、1
×
103、1
×
102、1
×
101和1
×
100。arms-qpcr检测fam与cy5 的结果分别如图3和图4所示：其中前6个稀释度各样品fam和cy5两个荧光通道的ct值均≤38，结果均为阳性，且有明显的扩增曲线，而1:107的
稀释度(1个拷贝数/反应)样品fam和cy5两个荧光通道的ct值均为no ct，且无扩增曲线；阴性对照样品的fam和cy5两个荧光通道的ct值均为no ct，且无扩增曲线。因此，i型asfv的敏感性检测结果为10个拷贝/反应。
[0131]
(3)ii型asfv敏感性检测
[0132]
用ii型asfv阳性质粒(拷贝数107/2μl)，按照1:10、1:102、1:103、1:104、 1:105、1:106和1:107进行梯度稀释，每管拷贝数分别为1
×
106、1
×
105、1
ꢀ×
104、1
×
103、1
×
102、1
×
101和1
×
100。arms-qpcr检测fam与cy5 的结果分别如图5和图6所示：其中7个稀释度各样品fam荧光通道的ct 值均≤40，结果均为阳性，且有明显的扩增曲线，而cy5荧光通道的ct值均为no ct，且无扩增曲线；阴性对照样品的fam和cy5两个荧光通道的 ct值均为no ct，且无扩增曲线。因此，ii型asfv的敏感性检测结果为1 个拷贝/反应。
[0133]
由此可见，本发明设计的引物、探针与反应条件鉴别检测i型和ii型 asfv的敏感性为1-10个拷贝/反应，能够满足实际检测需求。
[0134]
实施例4：特异性试验
[0135]
(1)方法
[0136]
将提取好的csfv、prrsv、prv、pcv2、pedv、tgev和porv的核酸作为特异性检测用模板样品，同样，根据反应体系中每个样品需要扩增试剂23μl进行配制，分装后再分别加入各2μl模板，同时设置阴性对照(无核酶水)、i型asfv阳性对照(i型asfv阳性质粒)和ii型asfv阳性对照(ii型asfv阳性质粒)，最后按照实施例2所示引物、探针和反应条件在 pcr仪设置程序，并进行arms-qpcr检测。
[0137]
(2)特异性试验结果
[0138]
对csfv、prrsv、prv、pcv 2、pedv、tgev和porv的核酸作为特异性验证用样品进行检测，在试验结果i型和ii型asfv成立(与图2所示结果模式一致)的条件下，各其他样品fam和cy5两个荧光通道的ct值均为no ct，且无扩增曲线，检测结果均为阴性(参见图7)。因此，本发明实施例2的方法对检测i型和ii型asfv的特异性良好。
[0139]
实施例5：受检样品的检测
[0140]
对asfv病毒株sd/dy-i/21株感染猪的血液、口腔拭子、肛门拭子、脾脏、扁桃体和颌下淋巴结样品各2份；对asfv病毒株pig/cn/hlj/2018株感染猪的血液、口腔拭子、肛门拭子、脾脏、扁桃体和颌下淋巴结样品各2 份和收集的现地i型和ii型asfv感染阳性猪血液样品各3份进行检测。阳性对照为：i型asfv阳性质粒和ii型asfv阳性质粒；阴性对照为：无核酶水。
[0141]
前述各个样品采用oie推荐的oie-qpcr方法进行平行测试。oie推荐的方法针对i型和ii型一致的保守区域设计的引物，具体参见表6；每个反应中引物oie-f和oie-r浓度均为50pmol(1μl)，oie-probe浓度为5 pmol(1μl)；反应程序为：1.50℃，2min；2.95℃，10min；3.95℃，15s，58℃ (此步收集荧光)，1min，40个循环。
[0142]
所有检测结果参见表7。
[0143]
表6：oie推荐的引物、探针信息
[0144][0145][0146]
注：“n”代表无修饰。
[0147]
表7：实验或现地收集样品检测结果
[0148]
[0149][0150]
注：“n”代表不适用。
[0151]
根据表7可见，对于i型asfv病毒株sd/dy-i/21感染猪后的样品，1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23号所有样品的fam和cy5两个荧光通道的ct值均≤38，与oie推荐的荧光pcr方法检测结果相符。
[0152]
对于ii型asfv病毒株pig/cn/hlj/2018感染猪后的样品，2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24所有样品的fam荧光通道的ct值均≤38，且cy5荧光通道的ct值均为no ct，与oie推荐的荧光pcr方法检测结果相符。
[0153]
25、27、29号样品fam和cy5两个荧光通道的ct值均≤38；26、28、 30号样品fam荧光通道的ct值均≤38，且cy5荧光通道的ct值均为no ct，均与oie推荐的荧光pcr方法检测结果相符。
[0154]
上述检测结果，完全符合asfv荧光定量pcr鉴别诊断的判定标准与条件，因此该方法能够用于i型和ii型asfv的鉴别诊断。
[0155]
本发明实施例2的荧光定量pcr检测方法能够灵敏、快速、准确、特异性的鉴别诊断血液、口腔和肛门拭子，以及组织等样品中i型和ii型asfv 基因组片段。
[0156]
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

技术特征：

1.一种核酸组合，所述核酸组合为第一核酸组合或第二核酸组合；所述第一核酸组合包括第一引物，第二引物，第三引物，第一探针和第二探针；所述第二核酸组合包括第四引物，第五引物，第六引物，第三探针和第四探针；其中：所述第一引物下游的特异性核酸序列如seq id no.3所示；所述第二引物下游的特异性核酸序列如seq id no.4所示；所述第三引物下游的特异性核酸序列如seq id no.5所示；所述第一探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.6所示，一端连接有第一荧光基团，另一端连接有第一淬灭基团；所述第二探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.7所示，一端连接有第二荧光基团，另一端连接有第二淬灭基团；所述第一淬灭基团能够淬灭所述第一荧光基团发出的荧光；所述第二淬灭基团能够淬灭所述第二荧光基团发出的荧光；所述第一荧光基团不能够淬灭所述第二荧光基团或所述第二淬灭基团发出的荧光；所述第一淬灭基团不能够淬灭所述第二荧光基团或所述第二淬灭基团发出的荧光；所述第二荧光基团不能够淬灭所述第一荧光基团或所述第一淬灭基团发出的荧光；所述第二淬灭基团不能够淬灭所述第一荧光基团或所述第一淬灭基团发出的荧光；所述第四引物下游的特异性核酸序列如seq id no.3所示；所述第五引物下游的特异性核酸序列如seq id no.9所示；所述第六引物下游的特异性核酸序列如seq id no.10所示；所述第三探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.6所示，一端连接有第三荧光基团，另一端连接有第三淬灭基团；所述第四探针中，核酸序列或其互补序列如seq id no.7所示，一端连接有第四荧光基团，另一端连接有第四淬灭基团；所述第三淬灭基团能够淬灭所述第三荧光基团发出的荧光；所述第四淬灭基团能够淬灭所述第四荧光基团发出的荧光；所述第三荧光基团不能够淬灭所述第四荧光基团或所述第四淬灭基团发出的荧光；所述第三淬灭基团不能够淬灭所述第四荧光基团或所述第四淬灭基团发出的荧光；所述第四荧光基团不能够淬灭所述第三荧光基团或所述第三淬灭基团发出的荧光；所述第四淬灭基团不能够淬灭所述第三荧光基团或所述第三淬灭基团发出的荧光。2.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述第一探针中，5’端连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；所述第二探针中，5’端连接有第二荧光基团，3’端连接有第二淬灭基团；优选地，所述第一荧光基团为cy5，所述第一淬灭基团为bhq2，所述第二荧光基团为fam，所述第二淬灭基团为tamra；或者所述第一荧光基团为fam，所述第一淬灭基团为tamra，所述第二荧光基团为cy5，所述第二淬灭基团为bhq2。3.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述第三探针中，5’端连接有第三荧光基团，3’端连接有第三淬灭基团；
所述第四探针中，5’端连接有第四荧光基团，3’端连接有第四淬灭基团；优选地，所述第三荧光基团为cy5，所述第三淬灭基团为bhq2，所述第四荧光基团为fam，所述第四淬灭基团为tamra；或者所述第三荧光基团为fam，所述第三淬灭基团为tamra，所述第四荧光基团为cy5，所述第四淬灭基团为bhq2。4.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述第一引物的核酸序列如seq id no.3所示；所述第二引物的核酸序列如seq id no.4所示；所述第三引物的核酸序列如seq id no.5所示。5.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述第四引物的核酸序列如seq id no.3所示；所述第五引物的核酸序列如seq id no.9所示；所述第六引物的核酸序列如seq id no.10所示。6.一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1-5中任一项所述的核酸组合。7.一种非诊断目的的鉴别检测基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒的方法，所述方法为：使用权利要求1-5中任一项所述的核酸组合对从目标检测样本所提取出来的核酸进行qpcr检测。8.如权利要求7所述的方法，所述方法包括如下步骤：s1：提取目标检测样本的基因组模板；s2：将所述基因组模板、所述第一核酸组合或第二核酸组合、qpcr反应试剂混合，得到反应体系；s3：对所述反应体系进行热循环，通过荧光信号针对i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒进行鉴别检测。9.如权利要求8所述的方法，所述热循环中，预处理为：95℃，30s，温度循环程序为：95℃，10s，60℃，30s，循环次数为38-42。10.权利要求1-5中任一项所述的核酸组合或权利要求6所述的试剂盒在制备鉴别检测基因i型非洲猪瘟病毒与基因ii型非洲猪瘟病毒的制剂或系统中的应用。

技术总结

本发明公开了基因I型与II型非洲猪瘟病毒鉴别检测引物及其应用，具体为一种核酸组合，包括序列如SEQ ID NO.3所示的第一引物，序列如SEQ ID NO.4所示的第二引物，序列如SEQ ID NO.5所示的第三引物，序列如SEQ ID NO.6所示、5’端连接有Cy5、3’端连接有BHQ2的第一探针，以及序列如SEQ ID NO.7所示、5’端连接有FAM、3’端连接有TAMRA的第二探针。本发明还公开了包含前述核酸组合的试剂盒，以及前述核酸组合或前述试剂盒在制备鉴别检测基因I型与II型非洲猪瘟病毒的制剂或系统中的应用。该核酸组合敏感性好，特异性高，能够通过qPCR对基因I型与II型非洲猪瘟病毒的核酸进行有效的鉴别检测。型非洲猪瘟病毒的核酸进行有效的鉴别检测。型非洲猪瘟病毒的核酸进行有效的鉴别检测。