一种用于肝病检测的标志物组合及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于肝病检测的标志物组合及其应用。

背景技术：

2.原发性肝癌简称肝癌，是全世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤。根据globocan 2018 公布的新数据，全球肝癌的年新发病例数达到84.1万人，居于恶性肿瘤第6位，死亡78.2万人，居于恶性肿瘤的第2位。原发性肝癌的病理类型主要是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc），占85%~90%。如果及早发现，通过手术切除、原位肝移植或消融手术例如微波或射频消融，肝癌可以治愈。然而，超过70%肝癌被诊断已经是晚期疾病，不适合治愈性，其中中位生存期通常在1-3年之间。因此，迫切需要能够使肝癌尽早确诊的方法。
3.目前的肝癌早筛策略包括对一些标志物的检测，通过检测标志物在患者体内的含量诊断肝癌。血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，afp）是用于肝癌检测的标志物之一，临床上，afp阳性是指afp≥400ng/ml，排除慢性或活动性肝炎、肝硬化、睾丸或卵巢胚胎源性肿瘤以及妊娠等，高度怀疑肝癌。但是在小肝癌以及早期肝癌的检测中，假阴性较高，作为肝癌的早期筛查指标也不十分理想。因此，美国肝病研究学会（aasld）和欧洲肝病学会（easl）已不再将afp作为肝癌筛查、诊断的必备指标。甲胎蛋白异质体afp-l3是肝癌细胞所特有，随着癌变程度的增加相应升高，因此常用afp-l3占afp的百分比（afp-l3%）作为原发性肝癌的检测指标，可比影像学提前4.0
±
4.9个月发现直径《2cm的小肝癌。异常凝血酶原（dcp，又称pivka-ii），是伴随肝癌特异产生的异常凝血酶原。作为afp 的补充，dcp对于afp阴性的肝癌具有一定的诊断价值，已作为肝癌肿瘤标志物进入临床应用阶段。有研究报道，dcp≥40mau/ml诊断早期肝癌的灵敏度和特异性分别为64%和89%，准确度为86.3%。
4.现有技术中有很多关于肝癌标志物的研究，例如中国专利cn114487426a公开了一种预测男性乙肝病毒感染者肝癌风险的组合标志物及其应用，包括γ-谷氨酰基转肽酶、血小板、白细胞、白蛋白和肝硬化指标中的至少一种，和甲胎蛋白以及异常凝血酶原。中国专利cn114592066a公开了一种新型多靶点肝癌早期检测的组合标志物及其应用，通过从肝癌组织、癌旁组织、肝炎患者样本的高深度全基因组甲基化数据中到了系列新型的、能高效区分肝癌和肝炎患者的甲基化位点，可用于早期肝癌的高效检测；将该新型基因甲基化位点与其他肝癌检测标志物（如afp、afp-l3和dcp）组合，能进一步提高auc值，提高早期肝癌筛查的灵敏度和特异性。然而，即使是涉及多个标志物共同检测的方法，其特异性和灵敏度仍存在一定欠缺，因此，新的检测标志物和特异性，灵敏度更高的检测方法或检测产品需要进一步研究。

技术实现要素：

5.本发明的发明目的在于提供一种适用于各种病因导致的肝癌的通用标志物组合。
在使用标志物组合对肝癌进行检测的过程中，能够有效提高检测的准确度、特异性和灵敏度。肝癌的尽早确诊，尽早进行相关。
6.为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
7.一种多肽组合物，包括壳多糖酶3样蛋白1（chi3l1）和以下至少一种多肽：甲胎蛋白（afp）、甲胎蛋白异质体（afp-l3）或异常凝血酶原（dcp）。
8.壳多糖酶3样蛋白1（chi3l1），又名ykl-40，是一种新发现的炎症标志物，参与纤维化的形成，具有重要临床价值。本技术通过实验验证chi3l1具有作为诊断肝癌标志物的作用，能够检测出afp，afp-l3以及dcp三阴性的肝癌患者。因此提高了检测的准确度，并且有利于肝癌的早发现，早。
9.在一优选实施例中，上述组合物中各多肽的浓度分别为：壳多糖酶3样蛋白1＞72.68ng/ml、甲胎蛋白＞6.011ng/ml、甲胎蛋白异质体＞0.83ng/ml或异常凝血酶原＞33.96ng/ml。
10.在一优选实施例中，上述组合物来源包括：全血、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、脑脊液或腹水。
11.在一优选实施例中，上述组合物中各多肽在血清中的浓度分别为：壳多糖酶3样蛋白1＞72.68ng/ml、甲胎蛋白＞6.011ng/ml、甲胎蛋白异质体＞0.83ng/ml或异常凝血酶原＞33.96ng/ml。
12.在一优选实施例中，多肽组合物为壳多糖酶3样蛋白1、甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原。
13.本发明的另一个目的在于，提供一种核酸分子组合物，包括编码壳多糖酶3样蛋白1的dna和以下至少一种核酸分子：编码甲胎蛋白的dna；或编码甲胎蛋白异质体的dna；或编码异常凝血酶原的dna。
14.在一优选实施例中，上述的核酸分子组合物，还包括编码壳多糖酶3样蛋白1的cdna和以下至少一种核酸分子：编码甲胎蛋白的cdna；或编码甲胎蛋白异质体的cdna；或编码异常凝血酶原的cdna。
15.在一优选实施例中，上述核酸分子组合物，还包括以下至少一种：由上述dna转录所得的rna分子；能够逆转录得到上述cdna的rna分子。
16.本技术公开的核酸分子组合物，能够作为检测肝癌的基因标志物，通过测定人体中上述核酸分子组合物的表达量，判断患者是否患有肝癌。
17.在一优选实施例中，上述核酸分子组合物来源包括以下至少一种：全血、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、脑脊液或腹水。
18.本发明还公开了上述核酸分子组合物的用途，包括以下至少一种：在制备用于诊断肝癌的产品中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的灵敏度中的用途；
在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的特异性中的用途；在制备提高肝癌诊断灵敏度的产品中的用途；在制备提高肝癌诊断特异性的产品中的用途；在制备用于肝癌筛查的产品中的用途；在制备用于评估肝癌风险的产品中的用途；在制备用于肝癌预后评估的产品中的用途；在制备诊断肝硬化的产品中的用途；本发明的再一目的为提供一种多肽组合物的用途，包括以下至少一种：在制备用于诊断肝癌的产品中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的灵敏度中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的特异性中的用途；在制备提高肝癌诊断灵敏度的产品中的用途；在制备提高肝癌诊断特异性的产品中的用途；在制备用于肝癌筛查的产品中的用途；在制备用于评估肝癌风险的产品中的用途；在制备用于肝癌预后评估的产品中的用途；在制备诊断肝硬化的产品中的用途；其中，所述多肽组合物包括壳多糖酶3样蛋白1和以下至少一种多肽：甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体或异常凝血酶原。
19.在一优选实施例中，上述灵敏度＞90%。
20.在一优选实施例中，上述特异性＞90%。
21.本发明的又一目的为提供一种用于肝病检测的试剂盒，包括检测壳多糖酶3样蛋白1含量的试剂和以下至少一种试剂：检测甲胎蛋白含量的试剂；或检测甲胎蛋白异质体含量的试剂；或检测异常凝血酶原含量的试剂。
22.在一优选实施例中，上述试剂还包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-pcr技术或生物素-亲和素技术检测所述多肽的物质。
23.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的灵敏度＞90%。
24.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的特异性＞90%。
25.在一优选实施例中，上述试剂盒为酶联免疫法检测试剂盒。
26.在一优选实施例中，酶联免疫法检测试剂盒包括抗壳多糖酶3样蛋白1抗体和以下至少一种试剂：抗甲胎蛋白抗体；或和抗甲胎蛋白异质体抗体；或抗异常凝血酶原抗体；上述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
27.在一优选实施例中，酶联免疫法检测试剂盒包括如下试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人壳多糖酶3样蛋白1抗体、大鼠抗壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗壳多糖酶3样蛋白1多克隆抗体；以及以下至少一组试剂：第一组：辣根过氧化物酶标记的抗人甲胎蛋白抗体、大鼠抗甲胎蛋白单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗甲胎蛋白多克隆抗体；第二组：辣根过氧化物酶标记的抗人甲胎蛋白异质体抗体、大鼠抗甲胎蛋白异质体单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗甲胎蛋白异质体多克隆抗体；第三组：辣根过氧化物酶标记的抗人异常凝血酶原抗体、大鼠抗异常凝血酶原单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗异常凝血酶原多克隆抗体。
28.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的灵敏度＞90%。
29.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的特异性＞90%。
30.在一优选实施例中，上述试剂盒为胶体金法检测试剂盒。
31.在一优选实施例中，酶联免疫法检测试剂盒包括抗壳多糖酶3样蛋白1抗体和以下至少一种试剂：抗甲胎蛋白抗体；或和抗甲胎蛋白异质体抗体；或抗异常凝血酶原抗体；在一优选实施例中，胶体金法检测试剂盒包括如下试剂：鼠抗壳多糖酶3样蛋白1抗体和胶体金标记的羊抗壳多糖酶3样蛋白1抗体；以及以下至少一组试剂：第一组：鼠抗甲胎蛋白抗体和胶体金标记的羊抗甲胎蛋白抗体；第二组：鼠抗甲胎蛋白异质抗体和胶体金标记的羊抗甲胎蛋白异质抗体；第三组：鼠抗异常凝血酶原抗体和胶体金标记的羊抗异常凝血酶原抗体。
32.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的灵敏度＞90%。
33.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的特异性＞90%。
34.在一优选实施例中，上述试剂盒为磁微粒化学发光法检测试剂盒。
35.在一优选实施例中，酶联免疫法检测试剂盒包括抗壳多糖酶3样蛋白1抗体和以下至少一种试剂：抗甲胎蛋白抗体；或和抗甲胎蛋白异质体抗体；或抗异常凝血酶原抗体；在一优选实施例中，胶体金法检测试剂盒包括如下试剂：
生物素标记的鼠抗壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体和吖啶酯标记的羊抗壳多糖酶3样蛋白1多克隆抗体；以及以下至少一组试剂：第一组：生物素标记的鼠抗甲胎蛋白单克隆抗体和吖啶酯标记的羊抗甲胎蛋白多克隆抗体；第二组：生物素标记的鼠抗甲胎蛋白异质体单克隆抗体和吖啶酯标记的羊抗甲胎蛋白异质体多克隆抗体；第三组：生物素标记的鼠抗异常凝血酶原单克隆抗体和吖啶酯标记的羊抗异常凝血酶原多克隆抗体。
36.在一优选实施例中，上述试剂盒所检测的样本包括：全血、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、脑脊液或腹水。
37.在一优选实施例中，上述试剂盒所检测的样本为血清。
38.在一优选实施例中，上述试剂盒有效期至少为1年。
39.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的灵敏度＞90%。
40.在一优选实施例中，上述试剂盒诊断肝癌的特异性＞90%。
41.本发明的又一目的为提供一种复合物组合，包括以下至少一种：抗体-壳多糖酶3样蛋白1复合物；或抗体-甲胎蛋白复合物；或抗体-甲胎蛋白异质体复合物；或抗体-异常凝血酶原复合物。
42.在一优选实施例中，复合物组合包括：抗体-壳多糖酶3样蛋白1复合物和抗体-甲胎蛋白异质体复合物。
43.在一优选实施例中，复合物组合包括：抗体-壳多糖酶3样蛋白1复合物和抗体-异常凝血酶原复合物。
44.在一优选实施例中，复合物组合包括：抗体-壳多糖酶3样蛋白1复合物、抗体-甲胎蛋白复合物、抗体-甲胎蛋白异质体复合物和抗体-异常凝血酶原复合物。
45.在一优选实施例中，上述抗体含有检测标记物，所述标记物包括以下至少一种：酶；或生物素；或链亲和素；或荧光蛋白；或化学发光标记；或胶体金。
46.在一优选实施例中，酶包括辣根过氧化物酶。
47.在一优选实施例中，化学发光标记包括吖啶酯。
48.在一优选实施例中，上述复合物的用途，包括以下至少一种：在制备提高肝癌诊断灵敏度的产品中的用途；在制备提高肝癌诊断特异性的产品中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的灵敏度中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的特异性中的用途。
49.在一优选实施例中，上述灵敏度＞90%。
50.在一优选实施例中，上述特异性＞90%。
51.本发明还公开了壳多糖酶3样蛋白1的用途，包括以下至少一种：在制备用于诊断肝癌的产品中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的灵敏度中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的特异性中的用途；在制备提高肝癌诊断灵敏度的产品中的用途；在制备提高肝癌诊断特异性的产品中的用途；在制备用于肝癌筛查的产品中的用途；在制备用于评估肝癌风险的产品中的用途；在制备用于肝癌预后评估的产品中的用途；在制备用于诊断afp、afp-l3和dcp三阴性肝癌患者的产品中的用途；在构建肝癌诊断模型中的用途。
52.壳多糖酶3样蛋白1在肝癌检测方面有巨大的潜力，能够有效提高诊断的特异性、灵敏度和准确性。并且在使用甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体或异常凝血酶原无法诊断的情况下，能够使用壳多糖酶3样蛋白1作为标志物对肝癌进行准确诊断，有利于肝癌患者尽早确诊，提高成功率和生存率。
53.在一优选实施例中，用于构建肝癌诊断模型时，包括以下至少一种模型：chi3l1-afpl3模型；或chi3l1-afp模型；或chi3l1-dcp模型；或ca3d模型。
54.在一优选实施例中，上述模型包括以下至少一种：chi3l1-afpl3模型：chi3l1-afpl3评分=40.5887
×
afp-l3+0.0246
×
chi3l1-27.4235；chi3l1-afp模型：chi3l1-afp评分=0.1047
×
afp+0.0238
×
chi3l1-26.5124-3.4024；chi3l1-dcp模型：chi3l1-dcp评分=0.0270
×
dcp+0.0240
×
chi3l1-3.4573；ca3d模型：ca3d评分=0.0129
×
afp+37.2319
×
afp-l3+0.0259
×
dcp+0.0237
×
chi3l1-26.5124；以上公式中：afp为受测样本中afp的含量（ng/ml）；
afp-l3为受测样本中afp-l3的含量（ng/ml）；dcp为受测样本中dcp的含量（ng/ml）；chi3l1为受测样本中chi3l1的含量（ng/ml）。
55.本发明诊断模型具有准确度高、特异性强、灵敏度高的特点，还有利于检测不易被检出的肝癌，能够帮助患者尽早确诊肝癌，从而增加治愈和生存的几率。
56.在一优选实施例中，确诊肝癌的判断标准为：受试患者评分高于对照人评分的中值。
57.在一优选实施例中，上述诊断模型诊断肝癌的灵敏度＞90%。
58.在一优选实施例中，上述诊断模型诊断肝癌的特异性＞90%。
59.在一优选实施例中，用于构建肝癌诊断模型时，构建方法，包括如下步骤：步骤1：分别从对照人和肝癌患者体内抽取体液；步骤2：对患者体液内标志物含量进行测定；步骤3：对标志物含量进行统计分析；步骤4：根据统计分析结果构建模型。
60.在一优选实施例中，上述体液包括以下至少一种：全血、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、脑脊液或腹水。
61.在一优选实施例中，上述体液为血清。
62.在一优选实施例中，上述对照人包括健康人或未患肝癌的其他肝病患者。
63.在一优选实施例中，上述标志物包括以下至少一种：壳多糖酶3样蛋白1、甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体或异常凝血酶原。
64.在一优选实施例中，上述标志物包括：壳多糖酶3样蛋白1、甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原；含有该标志物组合的模型称为ca3d模型。
65.在一优选实施例中，上述统计分析的变量包括以下至少一种：壳多糖酶3样蛋白1的含量、甲胎蛋白的含量、甲胎蛋白异质体的含量或异常凝血酶原的含量。
66.在一优选实施例中，上述统计分析的变量还包括患者性别、年龄、血小板计数、总胆红素。
67.在一优选实施例中，上述统计分析包括回归分析。
68.在一优选实施例中，回归分析使用logistic回归模型，并绘制roc曲线进行分析，可以根据需要的灵敏度优先（出更多的癌症病人）或者是特异性优先（降低假阳性）来确定具体参数；根据分析结果形成评分公式。
69.在一优选实施例中，构建模型所需的对照人和肝癌患者的样本量，分别不低于30人。
70.在一优选实施例中，构建模型所需的对照人和肝癌患者的样本量，分别不低于80人。
71.在一优选实施例中，确诊肝癌的判断标准为：受试患者评分高于健康人评分的中值。
72.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明验证了chi3l1作为标志物诊断肝癌中的用途，并且还验证了chi3l1与afp、afp-l3或dcp组合在诊断肝癌中的用途，并且，chi3l1与afp、afp-l3或dcp任一种标志物组合，均能提高诊断的特异性，灵敏度和准确性；chi3l1还能够检出afp、afp-l3和dcp三阴性的肝癌患者，避免肝癌患者被漏检。并且，chi3l1还能检测出afp、afp-l3和dcp三阴性的肝癌患者，有利于患者尽早确诊肝癌并接受及时的。本发明还验证了chi3l1、afp、afp-l3和dcp组合，即ca3d模型在诊断肝癌中的用途，此外，本发明ca3d模型还极大地提高了诊断的特异性、灵敏度和准确性，特异性可达0.927，灵敏度可达0.933，准确性可达91.2%。因此，ca3d模型可用于肝癌的诊断，并对提高肝癌诊断的特异性、灵敏度和准确性做出贡献。因此，基于本发明的ca3d模型，进一步开发出的检测试剂、检测试剂盒也对临床症状轻微不易被检出的肝癌有较准确的提示作用，具有极高的医疗与实用价值。并且，本发明用于肝癌诊断的模型具有准确度高、特异性强、灵敏度高的特点，还有利于检测不易被检出的肝癌，能够帮助患者尽早确诊肝癌，从而增加治愈和生存的几率。
附图说明
73.图1为各标志物的roc曲线。
具体实施方式
74.这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的方法的例子。
75.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
76.实施例1验证肝癌患者和正常人四种生物标志物壳多糖酶3样蛋白1（chi3l1）、甲胎蛋白（afp）、甲胎蛋白异质体（afp-l3）或异常凝血酶原（dcp）的血清水平存在差异选择肝癌（hcc）患者和正常人分为hcc组和健康组，使用试剂盒检测chi3l1、afp、afp-l3和dcp的血清水平。
77.检测方法如下（以检测chi3l1为例，所使用试剂盒为杭州普望生物技术有限公司生产；其他标志物的检测方法可参考chi3l1的检测方法）：试剂盒包含：1、壳多糖酶3样蛋白1微孔酶标板：8孔
×
12条；微孔内包被有大鼠抗壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体，每个微孔可检测1个样本；使用铝箔袋密封，内含干燥剂；2、壳多糖酶3样蛋白1检测抗体：1瓶
×
11ml；辣根过氧化物酶标记山羊抗壳多糖酶3样蛋白1多克隆抗体，存放在含有牛血清白蛋白的酶联稀释液中；每孔加入量：100ul；3、壳多糖酶3样蛋白1样本稀释液：1瓶
×
50ml；成分为含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，用于检测前对样本稀释；4、显剂：1瓶
×
11ml；含有3，3'，5，5'-四甲基联苯胺的缓冲液；每孔需要量：100ul；5、洗涤液（30
×
）：1瓶
×
30ml；应稀释30倍使用；6、终止液：1瓶
×
6ml；1 mol/l的稀硫酸溶液，每孔需要量：50ul；
7、不干胶片：2片；8、壳多糖酶3样蛋白1校准品：含重组人壳多糖酶3样蛋白1、牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，共6瓶，每瓶0.50ml。
78.校准品中壳多糖酶3样蛋白1浓度如表1所示：表1 校准品中壳多糖酶3样蛋白1浓度校准品012345chi3l1浓度（ng/ml）0124816具体检测方法如下：1、将试剂盒各组分平衡至室温。
79.2、配制工作浓度洗涤液（用超纯水做20倍稀释，待用）。
80.校准品、质控品按0.50ml/支充分溶解，室温放置15分钟以上。注意chi3l1校准品、质控品用去离子水溶解。
81.3、稀释样本：供chi3l1检测的血清样本用chi3l1样本稀释液稀释（建议500倍稀释）。如超过检测范围，请酌量选择稀释倍数。（样本推荐在96孔板上稀释，注意试剂盒提供的稀释液用量。）4、根据实验要求，选择一定量chi3l1酶标板条，并做好标记。将所用的微孔板条稳妥的放在支架上，并根据实验的需要编号。在开始吸取校准品、质控品和患者样本前，建议清晰地标记微孔板，以便在检验中和检验后明确辨别各样本的位置。
82.5、校准品、质控品、稀释样本按100μl/孔加样，校准品、质控品需做复孔，轻拍酶标板使混匀。
83.6、用不干胶片覆盖酶标板后，置于37℃孵育60分钟。
84.7、取出酶标板，撕去不干胶片后，弃去孔内液体，采用步骤２配制的工作浓度洗涤液按200μl/孔加液，静置30-60秒，弃去洗涤液，在干净的吸水纸上拍干，洗涤４次。如采用洗板机洗板，选择洗涤5次程序，300μl/孔加液，每次工作浓度洗涤液在微孔中停留时间为30-60秒，并每次吸净无残留，洗完后在干净的吸水纸上拍干。
85.8、加入相应的检测抗体，100μl/孔，用不干胶片覆盖酶标板，置于37℃孵育60分钟。
86.9、重复操作步骤7。
87.10、配制工作浓度hrp标记亲和素：用hrp标记亲和素稀释液将hrp标记亲和素（100
×
）按99:1混匀，100μl/孔，用不干胶片覆盖酶标板，置于37℃孵育30分钟。
88.11、重复操作步骤7。
89.12、显剂a：显剂b按体积比1:1混合，临用前配制。
90.13、将第12步配制好的显剂加入反应孔中，100μl/孔，室温避光反应15分钟。
91.14、在所有孔内加入50μl/孔终止液，轻拍酶标板，使之充分混匀。
92.15、酶标仪取波长450nm，读取od值。
93.结果计算：使用酶标仪带有内置的数据资料计算程序，输入各校准品chi3l1标示值，以计算出待测标本的浓度值。标准曲线拟合方式，使用四参数数学模型拟合，要求标准曲线相关系数应大于0.9900。
94.检测结果如表2和表3所示。
95.表2 健康组检测结果
样本数血清浓度平均值（ng/ml）95%ci血清浓度中位数（ng/ml）95%ciafp5513.7143.374-4.0542.6832.542-2.805afp-l35510.60.600-0.6000.60.600-0.600dcp55121.12419.843-22.40519.3518.630-20.420chi3l155162.72459.389-66.05852.1849.761-55.319
表3 肝癌组检测结果
样本数血清浓度平均值（ng/ml）95%ci血清浓度中位数（ng/ml）95%ciafp812428.24393.242-463.23880.62551.792-136.519afp-l3711405.165252.254-558.0774.4863.257-6.226dcp8123973.5413503.966-4443.115305219.707-414.468chi3l1812205.03194.699-215.361156.245146.400-165.487
由表2和表3可知，hcc组的四种生物标志物chi3l1、afp、afp-l3和dcp的血清水平均显着高于健康组（p 《0.001）。chi3l1在肝癌组均值205.03ng/ml，正常人均值62.724 ng/ml；afp在肝癌组均值428.24 ng/ml，正常人均值3.714ng/ml；afp-l3在肝癌组均值405.165，正常人均值0.6；dcp在肝癌组均值3973.541，正常人均值19.35。组间都有显著差异（p 《0.001）。因此，标志物chi3l1、afp、afp-l3和dcp均可作为检测肝癌的标志物。
96.实施例2验证chi3l1、afp、afp-l3和dcp检测肝癌的能力根据实施例1中标志物血清水平，构建受试者工作特征（roc）曲线，进一步评估标志物chi3l1、afp、afp-l3和dcp鉴别肝癌患者和健康人的能力。
97.roc曲线反映了灵敏度与特异度间的平衡，roc曲线下面积是重要的试验准确度指标，roc曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。
98.灵敏度（真阳性率）：实际为hcc患者而按实验标准被正确判断为hcc患者的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100%。
99.特异度（真阴性率）：实际为非hcc患者而按实验标准被正确判断为非hcc患者的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100%。
100.roc分析结果如图1和表4所示。
101.表4 roc分析结果
标志物或组合灵敏度特异性aucauc（95ci%,%）阈值（ng/ml）准确性（%）kappachi3l10.8610.8250.90689.9-92.472.6880.850.665afp0.750.9550.87885.9-89.26.01179.310.498dcp0.740.9780.82780.4-85.033.9682.10.611afpl30.6250.9980.81278.9-83.40.8376.150.514afp-afpl3-dcp0.8780.9580.92390.7-93.91.64788.110.791afp-afpl3-dcp-chi3l10.9330.9270.97796.9-98.43.97191.20.845
roc分析显示，使用chi3l1诊断hcc的auc和kappa值分别为0.906和0.665，数据集的最佳截止值为72.68ng/ml，超过了三个单一生物标志物中任何一个的性能。chi3l1与afp、afp-l3和dcp的组合进一步提高了性能，auc和kappa值分别为0.977和0.845。说明chi3l1与afp、afp-l3和dcp的组合，即ca3d模型能够用于对肝癌进行诊断，并且，ca3d模型极大地提高了检测的灵敏度和特异性。
102.实施例2分析结果说明，基于本发明的标志物组合，进一步开发出的检测试剂、检
测试剂盒也对临床症状轻微不易被检出的肝癌有较准确的提示作用，具有极高的医疗与实用价值。
103.实施例3验证chi3l1提高肝癌检测准确度的能力进一步对chi3l1与afp、afp-l3或dcp进行roc分析可得如表5所示分析结果。
104.表5 roc分析结果标志物组合auc准确性（%）chi3l1-afp0.95487.75chi3l-dcp0.94387.67chi3l-afp-l30.94887.32将表5数据与表4中单一标志物数据对比，任何和chi3l1的组合都显著提高了auc，chi3l1-afp的auc为0.954，chi3l-dcp的auc为0.943，chi3l-afp-l3的auc为0.948。chi3l1与afp、afp-l3和dcp的组合进一步提高了性能，auc和准确性分别为 0.977和91.2%。说明chi3l1具有提高检测准确度、灵敏度和特异性的能力。
105.此外，使用chi3l1作为标志物，对afp、afp-l3和dcp三阴性的hcc病例进行chi3l1血清水平的检测，以72.68 ng/ml作为临界值，得到如表6所示结果。
106.表6 chi3l1对afp、afp-l3和dcp三阴性的hcc病例的检测结果
样本数detectionrate（%）totalhcccases847-afp，afp-l3，dcp三阴性且chi3l1》72.68（ng/ml）10712.63
由表6可知，chi3l1有助于在847例中识别出107例（12.63%）afp、afp-l3、dcp三阴性hcc病例，进一步说明chi3l1具有提高检测准确度、灵敏度和特异性的能力，并且能够检测出症状不明显或不易被检出、易被漏检的患者。
107.实施例3分析结果说明，基于本发明的标志物组合，进一步开发出的检测试剂、检测试剂盒也对临床症状轻微不易被检出的肝癌或afp、afp-l3和dcp三阴性肝癌有较准确的提示作用，具有极高的医疗与实用价值。
108.本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
109.实施例4肝癌诊断模型对肝癌的诊断一、模型的构建步骤1：分别从健康人和肝癌患者体内抽取血液，并分离血清；步骤2：对患者血清内壳多糖酶3样蛋白1、甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原含量进行测定；步骤3：对标志物含量使用logistic回归模型进行统计分析，并绘制roc曲线，计算曲线下面积；步骤4：根据统计分析结果构建如下模型：chi3l1-afpl3模型：chi3l1-afpl3评分=40.5887
×
afp-l3+0.0246
×
chi3l1-27.4235；chi3l1-afp模型：
chi3l1-afp评分=0.1047
×
afp+0.0238
×
chi3l1-26.5124-3.4024；chi3l1-dcp模型：chi3l1-dcp评分=0.0270
×
dcp+0.0240
×
chi3l1-3.4573；ca3d模型：ca3d评分=0.0129
×
afp+37.2319
×
afp-l3+0.0259
×
dcp+0.0237
×
chi3l1-26.5124；以上公式中：afp为受测样本中afp的含量（ng/ml）；afp-l3为受测样本中afp-l3的含量（ng/ml）；dcp为受测样本中dcp的含量（ng/ml）；chi3l1为受测样本中chi3l1的含量（ng/ml）。
110.二、病例诊断以编号为gx121号的患者为例，该患者确诊肝癌前已确诊肝硬化；2020.8.5入组时测定该患者chi3l1、afp、afp-l3和dcp的血清水平，测定结果如表7所示：表7 患者标志物检测结果
chi3l1（ng/ml）afp-l3（ng/ml）afp（ng/ml）afp-l3%（ng/ml）dcp（ng/ml）年龄性别402.693.589.07539.52110.9851岁男
由表可知，患者afp小于20ng/ml，dcp小于40ng/ml，均低于现有肝癌诊断标准，按照现有肝癌诊断标准难以确诊；而患者chi3l1高达402.69，提示有患肝癌的风险，因此使用ca3d模型进行评估，计算得该患者ca3d评分为116.7。同时期评定肝硬化患者（84人）ca3d评分，肝硬化患者ca3d评分的中值为0.53，gx121号患者的ca3d评分远高于该中值，可确诊肝癌。
111.而实际上，该患者在2020.8.5并未根据ca3d模型确诊肝癌，而是根据现有的肝癌诊断标准，直至2022.1.3才确诊肝癌。说明ca3d可提前1年4个月诊断该病人为肝癌，具有识别不易被检出的肝癌的能力，在肝癌早期诊断中具有价值。
112.以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种多肽组合物，其特征在于，包括壳多糖酶3样蛋白1和以下至少一种多肽：甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体或异常凝血酶原。2.如权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述组合物中各多肽的浓度分别为：壳多糖酶3样蛋白1＞72.68ng/ml、甲胎蛋白＞6.011ng/ml、甲胎蛋白异质体＞0.83ng/ml或异常凝血酶原＞33.96ng/ml。3.一种核酸分子组合物，其特征在于，包括编码壳多糖酶3样蛋白1的dna和以下至少一种核酸分子：编码甲胎蛋白的dna；或编码甲胎蛋白异质体的dna；或编码异常凝血酶原的dna。4.如权利要求3所述的核酸分子组合物，其特征在于，还包括编码壳多糖酶3样蛋白1的cdna和以下至少一种核酸分子：编码甲胎蛋白的cdna；或编码甲胎蛋白异质体的cdna；或编码异常凝血酶原的cdna。5.如权利要求3所述的核酸分子组合物，其特征在于，还包括以下至少一种：由权利要求3所述核酸分子组合物转录所得的rna分子；或能够逆转录得到权利要求4所述核酸分子组合物的rna分子。6.一种多肽组合物的用途，其特征在于，包括以下至少一种：在制备用于诊断肝癌的产品中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的灵敏度中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的特异性中的用途；在制备提高肝癌诊断灵敏度的产品中的用途；在制备提高肝癌诊断特异性的产品中的用途；在制备用于肝癌筛查的产品中的用途；在制备用于评估肝癌风险的产品中的用途；在制备用于肝癌预后评估的产品中的用途；在制备诊断肝硬化的产品中的用途；其中，所述多肽组合物包括壳多糖酶3样蛋白1和以下至少一种多肽：甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体或异常凝血酶原。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述灵敏度＞90%。8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述特异性＞90%。9.一种用于肝病检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测壳多糖酶3样蛋白1含量的试剂和以下至少一种试剂：检测甲胎蛋白含量的试剂；或检测甲胎蛋白异质体含量的试剂；或检测异常凝血酶原含量的试剂。10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相谱法、毛细管凝胶电
泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-pcr技术或生物素-亲和素技术检测所述多肽的物质。11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒诊断肝癌的灵敏度＞90%。12.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒诊断肝癌的特异性＞90%。13.一种复合物组合，其特征在于，包括以下至少一种：抗体-壳多糖酶3样蛋白1复合物；或抗体-甲胎蛋白复合物；或抗体-甲胎蛋白异质体复合物；或抗体-异常凝血酶原复合物。14.如权利要求13所述的复合物，其特征在于，所述抗体含有检测标记物，所述标记物包括以下至少一种：酶；或生物素；或链亲和素；或荧光蛋白；或化学发光标记；或胶体金。15.权利要求13所述的复合物的用途，包括以下至少一种：在制备提高肝癌诊断灵敏度的产品中的用途；在制备提高肝癌诊断特异性的产品中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的灵敏度中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的特异性中的用途。16.壳多糖酶3样蛋白1的用途，包括以下至少一种：在制备用于诊断肝癌的产品中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的灵敏度中的用途；在提高诊断肝癌的产品肝癌诊断的特异性中的用途；在制备提高肝癌诊断灵敏度的产品中的用途；在制备提高肝癌诊断特异性的产品中的用途；在制备用于肝癌筛查的产品中的用途；在制备用于评估肝癌风险的产品中的用途；在制备用于肝癌预后评估的产品中的用途；在制备用于诊断afp、afp-l3和dcp三阴性肝癌患者的产品中的用途；在构建肝癌诊断模型中的用途。

技术总结

本发明公开了一种用于肝病检测的标志物组合及其应用，属于生物检测技术领域。本发明用于肝病检测的标志物组合包括以下至少一种：壳多糖酶3样蛋白1、甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体或异常凝血酶原。本发明还验证了CHI3L1、AFP、AFP-L3和DCP组合，即CA3D模型在诊断肝癌中的用途，此外，本发明CA3D模型还极大地提高了诊断的特异性、灵敏度和准确性，特异性可达0.927，灵敏度可达0.933，准确性可达91.2%。因此，CA3D模型可用于肝癌的诊断，并对提高肝癌诊断的特异性、灵敏度和准确性做出贡献。灵敏度和准确性做出贡献。灵敏度和准确性做出贡献。