姜瞻梅;赵艳娜;刘书云;田雨
【摘 要】钛合金热处理Effects of temperature on characteristics and antioxidant activities of glycosylation products derived from whey protein isolate （WPI） were studied by glycosylation modification technology. It was shown that when the reaction temperature was higher, the pH of glycosylated WPI conjugates was lower, but browning intensity and antioxi- dant activities became stronger. Antioxidative activities of different kinds of glycosylated WPI conjugates showed different improvement effects. Among all these conjugates, glycosylated conjugates derived from the Ribose-WPI system had the strongest antioxidant activity, and orders of antioxidant activities of other conjugates were as follows： Galac- tose-WPI 〉 Fructose-WPI 〉 Glucose-WPI 〉 Lactose-WPI.%利用糖基化修饰技术，以乳清分离蛋白（WPI）为研究对象，以褐变程度、pH值以及抗氧化活性为检测指标，研究反应温度对乳清蛋白糖基化反应特性和抗氧化活性的影响。研究结果表明：反应温度越高，糖基化反应后产物的pH值越低，褐变程度越大，抗氧化活性越强。不
同类型糖基复合物的抗氧化活性随反应温度增大有不同程度的提高，其他核糖-WPI体系中抗氧化活性最强，其次分别为半乳糖-WPI〉果糖-WPI〉葡萄糖-WPI〉乳糖-WPI。
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【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2012(038)008
【总页数】5页(P58-62)
【关键词】乳清分离蛋白（WPI）;糖基化反应;抗氧化活性;反应特性
【作 者】姜瞻梅;赵艳娜;刘书云;田雨
【作者单位】东北农业大学乳品科学教育部重点实验室东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030
【正文语种】中 文
【中图分类】TS202.3
乳清蛋白来源广泛、价格低廉，含有多种必需氨基酸，是一种营养丰富的全价蛋白质[1］，适合做食品基料，但它的某些不良理化特性限制了其应用范围，因此，加强和改善乳清蛋白的功能特性，扩大其在食品及其他领域的应用，成为国内外科学家们研究的热点。糖基化反应修饰技术可改善乳清蛋白功能特性，与化学方法和酶法对蛋白质改性相比，糖基化反应修饰技术不需化学试剂，安全性高，可极大改善乳清蛋白的乳化性、溶解性及热稳定性等功能特性。Li等人将麦芽戊糖通过美拉德反应引入乳清分离蛋白，研究显示乳清分离蛋白-麦芽戊糖共价复合物改善了乳清分离蛋白在加热、pH值为7条件下的溶解性[2］;郑喆等研究表明，乳清蛋白-葡萄糖糖基化产物的溶解性和热稳定性明显改善[3］;Vardhanabhuti等报道了硫酸葡聚糖通过糖基化反应，可提高β-乳球蛋白的热稳定性[4］。但是，利用糖基化反应修饰技术，提高乳清蛋白抗氧化活性的研究较少。本课题以乳清分离蛋白为研究对象，研究糖基化反应温度对乳清蛋白糖基化反应特性及抗氧化活性的影响，阐明糖基化反应温度因素与抗氧化活性的内在关系。
2，2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl(DPPH)，Sigma公司，美国;铁，天津市博迪化工有限公司;乳清蛋白分离物(WPI)，北京Milky Way商业公司;核糖，北京索莱宝科技有限公司;D-半乳糖，D-果糖，上海惠世生化试剂有限公司;葡萄糖，天津市东正精细化学试剂厂;乳糖，天津市科密欧化学试剂有限公司。
UV-2401PC紫外可见分光光度计，日本岛津公司;GL-21M离心机，上海市离心机械研究所;pH计，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;AL-104精密电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DK-8B电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;
将乳清蛋白与核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖分别按质量比1∶1的比例溶于纯净水，制成总固形物质量浓度为60 g/L的溶液，调节起始pH值为8。在反应温度分别为75、80、85、90、95、100℃的条件下，反应3 h，反应结束后，将制备好的样品迅速冷却至室温，测定pH值，冷冻贮存备用。
参照Ajandouz等人[5］的方法，并略作修改。将待测样品采用蒸馏水进行12倍稀释，测定其在420 nm条件下的吸光值;同时将待测样品在420 nm测定基础上采用蒸馏水进行5倍稀释，测定其在294 nm条件下的吸光值。
参照Oyaizu的方法[6］，并略作修改。取样品0.5 mL(现将样品配成1%的溶液)，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L，pH值为6.6)和2.5 mL的1%铁溶液，混合均匀。再将混合物在50℃下水浴保持20 min后急速冷却，加入2.5 mL的10%的三溶液，然后将混合物在3000 r/min下离心10 min。取2.5 mL上层清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5 mL的0.1%的氯化铁溶液，混合均匀，放置10 min后，在700 nm处测定其吸光值。
参照Saiga的方法[7］，并略作修改。将样品配成20 g/L的质量浓度，取样品液1.0 mL及4.0 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液(乙醇体积分数为95%)，混匀，室温下避光反应30 min。用体积分数为95%乙醇溶液作参比，于517 nm测定吸光值。根据下式计算每种样品液对DPPH自由基的清除率:
式中:Ai为加样品液后DPPH溶液的吸光值;Aj为样品液的吸光值;Ac为未加样品液时DPPH溶液的吸光值。
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数据统计分析采用SPSS13.0软件，进行Dundan多重比较，数据均以平均值±标准差表示(n=3)。
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糖基化过程往往伴随着体系pH值的降低，这是因为糖类和蛋白质发生糖基化反应过程中生成了小分子量的有机酸，如甲酸、乙酸等[8-9］。同时，氨基酸的消耗和酸性物质的形成也促使反应体系pH值的降低。不同反应温度条件下的糖基化反应产物的pH值变化，见图1。
由图1可知，反应后的pH值受温度因素影响较大。在同一起始pH值条件下，随着糖基化反应温度增加，不同类型糖基化复合物的pH值，呈现不同程度的降低。核糖-WPI体系的pH值降低最快，在75℃反应时从起始pH 8降至pH 6.53，而100℃反应时pH值降至5.14。当糖基化反应3 h后，半乳糖-WPI反应体系pH值降至起始pH值的78%;果糖-WPI和葡萄糖-WPI作为六碳糖，反应后的pH值变化接近，分别为起始pH值的84%和85%;乳糖-WPI作为二糖，反应后的pH值高于3种单糖，约为起始pH值的88%;单独加热WPI时pH值略有降低，可能由于热分解时，产生了少量的酸性物质。
一般来说，反应产物的褐变颜是糖基化反应程度的重要评价指标，且反应程度与褐变颜呈正相关。在糖基化反应过程中，420 nm和294 nm处的吸光值来监测反应的褐变程度大小[10］。
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420 nm处的吸光值反映了糖基化反应程度的大小，吸光值越大，说明其最终反应程度越大，反之则较小。而294 nm处的吸光值主要反映糖基化反应中间产物的颜，在一定程度上反映了糖基化的程度。不同反应温度条件下的糖基化反应产物，在420 nm和294 nm处的吸光值试验结果，分别见表1和表2。
从表1的方差分析可知，单独加热WPI时，随反应温度增大，其420 nm处的吸光值变化差异不显著(P＞0.05)。但是，随反应温度增大，核糖-WPI体系的吸光值，显著增大(P＜0.05);半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI在75℃和80℃的吸光变化不显著(P＞0.05)，而当反应温度升至85℃，420nm处的吸光值显著增大(P＜0.05);乳糖-WPI的420 nm处的吸光值在整个反应过程中变化较小。不同类型糖基化复合物在75℃和80℃的褐变程度变化不大，甚至略有下降，但当反应温度在85℃以上，其褐变程度随着反应温度的升高而增大。核糖-WPI体系的褐变程度最大，其次分别为半乳糖-WPI＞果糖-WPI＞葡萄糖-WPI＞乳糖-WPI。单独加热WPI后，其体系颜未发生改变。
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从表2的方差分析可知，随着反应温度的增大，WPI在294 nm处的吸光值变化差异不显著(P＞0.05)。但是，糖基化反应温度越高，核糖-WPI和半乳糖-WPI两体系在294 nm处的吸
光值越大(P＜0.05);果糖-WPI和葡萄糖-WPI的吸光值在75℃和80℃的吸光值变化差异不显著(P＞0.05)，而当反应温度升至85℃，其吸光值显著增大(P＜0.05);乳糖-WPI在相邻的两个温度范围(75℃和80℃、85℃和90℃、95℃和100℃)的吸光值变化差异不显著(P＞0.05)。由此可见，不同类型WPI糖基化产物的吸光值，随反应温度升高，呈现上升趋势。其中，核糖-WPI体系的吸光值受反应温度影响最大，其次分别为半乳糖-WP＞果糖-WPI＞葡萄糖-WPI，而WPI和乳糖-WPI两体系在294 nm处吸光值变化较小。
不同类型糖基复合物的褐变程度不同，主要是因为参加反应的糖的活性不同。还原糖的反应活性为:醛基戊糖＞醛基己糖＞酮基己糖＞二糖。由果糖得到的糖基复合物比葡萄糖的褐变程度大，可能是因为果糖比葡萄糖含有的开链结构比例高的缘故[11］。
糖基化复合物具有一定的抗氧化作用[12］，而抗氧化效果的强弱与还原能力具有一定的相关性。还原能力的测定方法是以测定的样品是否为良好的电子供体为重要标志，还原能力强的样品往往是优良的电子供体，测定样品所供应的电子能将Fe3+还原成Fe2+的同时，与自由基发生反应，从而使自由基成为更稳定的物质。这样就可以中断自由基的连锁反应[13］。复合物在700 nm处吸光值越大，表明其还原力越强。不同反应温度下WPI及其糖基化产物的还原能力试验结果见图2。
由图2可以看出，随着反应温度增大，WPI的还原能力差异不显著(P＞0.05)。不同类型的WPI糖基化产物的还原能力则随着温度增大，有不同程度的提高(P＜0.05)。其中，核糖-WPI糖基化产物的还原能力显著大于其它糖基化产物，75℃时其体系的还原能力值已相当于半乳糖-WPI在100℃时的1.8倍;半乳糖-WPI体系在100℃时的还原能力是75℃的4.3倍;果糖-WPI在100℃时的还原能力略高于葡萄糖-WPI，分别是其对应75℃的4.5和3.6倍;乳糖-WPI在100℃反应的还原能力仍较低，比75℃时提高了2.4倍。综上所述可知，糖基复合物还原能力强弱顺序分别为核糖-WPI＞半乳糖-WPI＞果糖-WPI＞葡萄糖-WPI＞乳糖-WPI，核糖-WPI、半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI的还原能力随温度升高而增大，乳糖-WPI的还原能力随温度增大而增加较小。除核糖-WPI以外，其他糖基复合物在75和80℃加热时，还原能力变化差异不显著。
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