一种用于骨缺损修复的组合物及支架的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于骨缺损修复的组合物及支架。

背景技术：

2.如今，临床骨缺损患者越来越多。骨缺损形成因素众多，包括应力遮挡、骨溶解、骨坏死和感染等。骨缺损的临床困难，目前手段有限，已成为严重影响手术预后的关键因素之一。骨缺损的病理机制异常复杂，其中非创伤性骨缺损多存在成骨困难，局部骨质疏松的特点。
3.既往研究已证实富血小板血浆(platelet-rich plasma，prp)在体内可释放多种高浓度的生长因子,并且各生长因子的比例与体内正常比例相符，由此具有最佳的协同作用，可弥补单一生长因子刺激成骨不佳的缺点。prp还可经凝血酶凝固成胶状,粘附至缺损处颗粒状移植骨,防止血小板流失,使血小板在局部长时间分泌生长因子,保持较高的生长因子浓度。
4.临床广泛应用的双磷酸盐(bisphosphonates，bps)能与骨质中的羟磷灰石特异结合，抑制破骨细胞活性，促进成骨细胞增殖分化，发挥促成骨效应。然而，口服双膦酸盐类药物不能在局部达到较高的浓度，常需应用较大剂量，存在发生非典型股骨骨折、骨石症等风险。
5.中国发明专利申请“cn105854074a用于牵引成骨术的组合物和方法”该文献公开的组合物包括包含含有血小板衍生生长因子(pdgf)和双磷酸盐(bps)的溶液以及生物相容性基质，其中所述溶液配置在该生物相容性基质中。该文献提供的组合物具有促进和加速骨牵引位点上的骨生成的作用。然而，实际应用中发现，这类材料的使用仍然存在较多的问题，其活性成分(pdgf、bps等)与生物相容性基质的种类和配比非常重要，如果不能选择合适的活性成分与生物相容性基质的种类和配比，容易出现活性成分释放过快或过慢、生物毒性过强等问题。严重影响这类复合材料在骨修复中的应用。
6.因而，仍然有必要进一步开发新的具有更好促进骨修复和骨整合效果的药物或支架材料。

技术实现要素：

7.针对现有技术的缺陷，本发明提供一种用于骨缺损修复的组合物，目的在于提供一种对骨修复和骨整合具有更好促进作用的组合物。
8.一种用于骨缺损修复的组合物，它包括如下重量份的组分：
9.双磷酸盐0.01-2份；
10.聚乳酸-羟基乙酸共聚物98-99.99份。
11.优选的，它包括如下重量份的组分：
12.双磷酸盐0.02-0.2份；
13.聚乳酸-羟基乙酸共聚物99.8-99.98份。
14.优选的，所述双磷酸盐选自阿仑膦酸钠和利塞膦酸钠中的至少一种。
15.优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5500-7500。
16.优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸单元和羟基乙酸单元的摩尔比例为(70-80):(20-30)。
17.优选的，所述组合物为粉末或线材。
18.本发明还提供一种用于骨缺损修复的支架，它是用如下重量份的原料制成的：
19.上述组合物90-95份；
20.富血小板血浆5-10份。
21.优选的，所述支架通过将所述组合物制成支架基体，然后将所述富血小板血浆附着在所述支架基体上后制成。
22.优选的，将所述富血小板血浆附着在所述支架基体的方法为使用凝血酶将富血小板血浆凝固在所述支架基体上。
23.优选的，所述富血小板血浆和凝血酶的用量比例为85-90：10-15。
24.本发明提供了一种用于促进骨缺损修复和整合的生物支架，该支架以双磷酸盐和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的组合物作为基本材料，附着富血小板血浆。通过对原料及其配比的优选，使得本发明的支架具有良好的理化特性和细胞生物相容性，达到最佳的促成骨及骨整合作用。
25.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
26.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
27.图1为3d打印制备的bps/plga骨缺省修复支架及sem照片(通过3d打印制备的样品，样品厚度2mm，直径8mm)。
28.图2为实验例1中的降解速率的测试结果。
29.图3为实验例1中的bps的释放动力学曲线。
30.图4为实验例1中prp/bps/plga支架与成骨细胞共培养1(a)、3(b)、5(c)天的光镜图片。
31.图5为实验例1中prp/bps/plga支架与成骨细胞共培养1、3、5天的细胞活力图。
32.图6为实验例2中prp/bps/plga支架植入股骨髁(a)的图片和植入后4周(b)、8周(c)、12周(d)的组织切片染结果。
具体实施方式
33.以下实施例和实验例中所用的试剂和材料，未特别说明的均为市售品。
34.实施例1一种用于骨缺损修复的支架
35.本实施例提供一种用于骨缺损修复的支架，其制备方法如下：
36.(1)将粉末状的双磷酸盐阿仑膦酸钠0.2份和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga，分子
量5500，济南岱罡生物工程有限公司)99.8份混合，得到bps/plga混合粉末，bps/plga混合粉末用于作为后续3d打印的原料；其中，双磷酸盐选择的种类为阿仑膦酸钠，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为6500，乳酸单元和羟基乙酸单元的摩尔比例为75：25；
37.(2)通过建模，获得多孔结构模型；
38.(3)使用生物高分子打印机打印bps/plga混合粉末制成bps/plga支架；本实施例制备的支架如图1所示。测定支架的孔径、孔隙率，支架的孔径为250微米，200孔隙率为65％。
39.(4)将富血小板血浆通过凝血酶凝固在bps/plga支架上，得到最终用于植入骨缺损部位的生物支架(prp/bps/plga支架)。其中富血小板血浆和凝血酶比例为90:10，富血小板血浆和bps/plga支架的用量比例为5:95。
40.下面通过实验例对本发明的技术效果作进一步的说明。
41.实验例1 bps/plga用量比例筛选
42.一、实验方法
43.调整bps用量，按照实施例1的方法制备用于骨缺损修复的支架。
44.三个实验组的bps、plga用量重量比为：
45.实验组1：bps/plga＝0.02:99.98,
46.实验组2：bps/plga＝0.2:99.80,
47.实验组3：bps/plga＝2:98。
48.实验的对照组为纯plga材料按照实施例1的方法制成的支架。
49.进行如下测试：
50.1、降解速率
51.精确测量每个样品的重量记为初重mi(i＝1,2,3,4；分别表示plga、plga-0.02％as、plga-0.2％as、plga-2％as样品)。按去离子水：样品＝30:1的质量比将测重后的样品放入去离子水中，装入离心管内密封(每天更换管内的浸泡液)，将离心管置于恒温水浴振荡箱内(37℃、72rpm)。更换溶液时取出样品，用无水乙醇浸泡5分钟后室温风干，再测量每个样品的重量mni。计算每个时间点(浸泡时间点：1，2，4，8，12周)每个实验样品的降解速率：降解速率pni＝(mi-mni)/mi
×
100％。
52.2、bps的释放动力学曲线
53.将测试降解速率换出的液体收集起来，混合。在1,2,4,8周用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测定每份浸泡液中的磷元素浓度。
54.3、体外细胞试验评估
55.将成骨细胞与prp/bps/plga复合生物支架体外联合培养，光镜观察细胞与支架复合情况；cck8法检测细胞活力。
56.二、实验结果
57.样品的降解速度如图1所示，样品在浸泡一周后出现轻微的膨胀，支架表面显得较为光滑。分析其原因可能是由于第一周，样品大量吸水，水分子进入分子链之间，材料出现溶胀现象所致。浸泡2周后，观察到样品明显变软，这可能是样品吸水后分子链断裂所导致的结果。随着浸泡时间增加，到第四周时，个别样品已经凝胶化，到第六周时，部分样品已经破裂为小块。到第八周时，样品组的样品已经全部破裂为小块，说明材料降解较快。而对照
组样品，软化现象相对于样品组，至第十二周时，样品方才破裂。这表明本发明提供的支架相比于纯plga材料制成的支架具有更快的降解速度。
58.bps的释放曲线如图3所示，样品在第一周释放的双磷酸盐的浓度较高，表现出较高的磷浓度。随着浸泡时间增加，含有实验组1和实验组2的变化不明显，而实验组3在第2周后，略有上升。分析其原因可能是由于材料降解过程中，由于存在材料吸水和材料溶出平衡，所以在降解率下降的条件下仍然有磷酸盐释放出来。而对于实验组3的样品，样品中的双磷酸盐的含量较高，影响了支架高分子的结晶，表现出更快的材料溶出，从而释放出更多的双磷酸盐。这一结果与降解实验结果相符合。
59.体外细胞试验评估结果如图4、5所示，图4中实验组2与成骨细胞共培养1,3,5天光镜图片显示，随着时间增加成骨细胞逐渐增加，成骨细胞形貌正常。表明本发明的支架具有促进骨修复的功效。图5中细胞活力图显示，实验组1、实验组2和实验组3的支架均能够提高细胞活力，但是对于bps用量较高的实验组3，随着培养时间的增加，细胞活力有所降低。
60.通过上述实验证明，bps、plga用量比例在0.02-0.2：99.8-99.98为较优选择，更优的为0.02：99.98。
61.实施例2 prp/bps/plga支架用于骨缺损修复的动物实验
62.一、实验方法
63.1.兔骨缺损模型的建立：选用新西兰大白兔，2.5-3.5kg，独立饲养，自由进食，饲养一周后用于实验。手术过程：全麻，剃毛，固定于手术台，碘伏消毒。自双后肢膝关节外侧距前缘1.0～1.5cm处，平行前缘作一长约5cm弧形切口；逐层分离暴露股骨外侧髁解剖标志，用环形中空取骨钻制备直径6mm、深8mm的圆柱形骨缺损。于距离骨缺损中央6mm处，左右对称各旋入1枚直径2mm的钛钉定位。过程中，冲洗液冲洗降温，注意保护血管和神经束。
64.2.体内研究prp/bps/plga促成骨的骨修复作用:成功建立兔股骨髁骨缺损模型，缺损尺寸直径6mm、深8mm。随机分为5组：a组，植入多孔plga支架；b组，植入bps/plga支架；c组，植入prp/plga支架；d组，植入prp/bps/plga支架；e组，空白对照组。术后动物肌肉内注射庆大霉素4万u/天，连续3天。术后1，2，3月组织学观察新骨生成及与周围骨组织和材料的整合与长入。
65.二、实验结果
66.如图6所示，第4周，材料出现明显的降解，观察到少量新生骨，第8周，支架降解更多，新生骨量增加，第12周，支架几乎完全降解，新生骨变为成熟骨组织，表明本发明的prp/bps/plga支架对骨修复确实有很好的效果。
67.通过上述实施例和实验例可以看到，本发明通过优选原料组成和配比，提供了一种用于骨缺损修复的支架，其具有良好的理化特性和细胞生物相容性，达到最佳的促成骨及骨整合作用。本发明在骨修复中具有很好的应用前景。

技术特征：

1.一种用于骨缺损修复的组合物，其特征在于：它包括如下重量份的组分：双磷酸盐0.01-2份；聚乳酸-羟基乙酸共聚物98-99.99份。2.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于：它包括如下重量份的组分：双磷酸盐0.02-0.2份；聚乳酸-羟基乙酸共聚物99.8-99.98份。3.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述双磷酸盐选自阿仑膦酸钠和利塞膦酸钠中的至少一种。4.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5500-6500。5.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸单元和羟基乙酸单元的摩尔比例为(70-80):(20-30)。6.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物为粉末或线材。7.一种用于骨缺损修复的支架，其特征在于：它是用如下重量份的原料制成的：权利要求1-6任一项所述的组合物90-95份；富血小板血浆5-10份。8.按照权利要求7所述的支架，其特征在于：所述支架通过将所述组合物制成支架基体，然后将所述富血小板血浆附着在所述支架基体上后制成。9.按照权利要求8所述的支架，其特征在于：将所述富血小板血浆附着在所述支架基体的方法为使用凝血酶将富血小板血浆凝固在所述支架基体上。10.按照权利要求9所述的支架，其特征在于：所述富血小板血浆和凝血酶的用量比例为85-90：10-15。

技术总结

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于骨缺损修复的组合物及支架。本发明结合影像成像和3D打印技术，采用FDA批准用于植入的高分子材料PLGA，根据骨缺损形态构建个性化的双相负载富血小板血浆和双磷酸盐支架，共同促进骨缺损处骨修复及骨整合。本发明的支架在骨缺损的临床中具有很好的应用前景。骨缺损的临床中具有很好的应用前景。骨缺损的临床中具有很好的应用前景。