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一、 实验目的
2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤
3.掌握酵母生产性能的测定:酵母凝聚性的测定、酵母发酵力的测定、酵母 产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、 4.掌握用 DNS 法测定还原糖及其酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力 5.防误闭锁学习酒精出酒率的计算
二、 实验器材
1.实验器材 恒温培养箱,高压灭菌锅,三角瓶,电磁炉,水浴锅,微波炉,移液, 头,容量瓶,冷凝管,蒸馏烧瓶,铁架台,软管,连通器,天平,酒精 计,超净工作台,
摇床,试管,紫外分光光度仪,培养皿,玻璃棒,涂布 棒,离心管,离心机,漏斗,滤纸,玻璃珠, pH 试纸 2.试剂及药品 碘液,20%盐酸溶液,20%氢氧化钠溶液,500?g/ml 标准葡萄糖溶液,玉 米粉,糖化酶,马铃薯,酒糟,无水乙醇,蒸馏水,DNS 试剂,可溶性淀 粉,葡萄糖 3.实验材料 番茄 4.实验培养基 PDA 马铃薯 蔗糖(或葡糖糖) 琼脂 水 PH 200g 20g 15-20g 1000ml 自然 马铃薯去皮, 切成块煮沸半小时, 用纱布过滤, 在加糖和琼脂, 定容至 1000ml。 121℃灭菌 30min。 DNS 试剂 酒石酸钾钠 18.2g,溶于 50ml 蒸馏水中,加热,于热溶液中依次加入 3,5二硝基水杨酸 0.03g,NaOH2.1g,苯酚 0.5g,搅拌至溶,冷却后用蒸馏水定 容至 100ml 发酵工艺(技术路线) 三、 实验步骤
(一)酵母菌种的驯化筛选 1. 酵母菌种的筛选分离 筛选 采用平板涂布法和划线法。将榨取的番茄汁稀释到 10-3、10-4、10-5 后在 PDA 培养基平板上涂布,后置于 28℃隔水式恒温培养箱中静止培养 3 d;从分离得到 的酵母菌落中挑取一环酵母菌在 PDA 平板上划线,后置于 28℃隔水式恒温培养 箱中静止培养 2 d。
2. 酒精发酵液的微生物检查 1)酵母形态的观察 用美蓝染法取对数生长期的菌体进行制
片, 在放大 10 倍及 40 倍的显微镜 下观察酵母形态,用测微尺测量酵母细胞的大小,并进行死活鉴别。
(二)测定指标及其方法
1. 酵母生产性能鉴定 (1) 酵母菌产酒精能力(发酵力)的测定 本实验主要采取称重法与测放出的 CO2 量等测定酵母的发酵力。 称重法: 我们将不同酵母菌产酒精能力的测定和酒精发酵合在一起。
2.操作: ①糊化:将 625mL 水加到糖化锅中,按照料水比 1:5 称取玉米粉 125g,在电 炉上加热并搅拌,调节 pH5.5~6.0,观察现象,记录下黏度迅速增加时的温度。 ②糖化:待醪液冷却到 60℃,调节 pH 值至 4.0-4.5,用移液(按 0.6~0.8%/g 淀粉)量取糖化酶加入糖化锅中,搅拌均匀,放入水浴锅中,保持温度为 60℃, 维持约 10h,用碘液测定糖化液是否含还有淀粉,若未完全则继续糖化直至完全 为止。注意开始时液面位置并随时补足由于水的蒸发造成的液面降低。 ③糖化结束后将糖液 pH 值调至 5.0 左右。 ④取一些糖化好的糖化液,测定其还原糖的含量(用 DNS 法测定)。 ⑤将糖化好的糖化液分装 5 个 250 毫升的三角瓶(每个约 150 毫升),接种培养 24 小时的酵母菌,接种量为
发酵液的 10%(约 15 毫升)。 ⑥用干布将三角瓶各部分擦干净, 称量初始发酵液的重量, 将发酵液放于 28-30℃ 的培养箱中发酵,并于以后每天称量一次,直至重量减至恒重为止。 (2) 酵母菌耐酒精能力的测定: 将产酒精能力最强的菌体用去离子水洗涤 2 次 , 后于 30℃和不同的酒精浓 度(0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%)条件下进行试验 ,定期取样检测 活细胞目:菌体的耐酒精能力以酵母细胞增长数表示 ,酵母细胞增长数 (%)=(C1-C0/t)×100%, 1 和 C0 分别表示发酵时间为 t 小时的细胞数和刚开始 C 时的细胞数,以表示酵母菌在不同的酒精浓度下的耐酒精能力,连续观察 5 天。 (3)酵母凝聚性的测定 本实验采用本斯值法。将酵母茵在 30℃度摇床中摇瓶培养 36 h,离心弃上清 液,经无菌水洗涤 3 次后,称重 1 g gammaproteobacteria酵母菌泥于刻度 15 mL 的离心管中,注入 10 mL pH 值为 4.5 高频整流器的醋酸盐缓冲液, 20℃水浴中放置 20 min 后, 摇动离心管 5 min 使酵母细胞重新均匀悬浮,静置,记录 i0 min 时酵母细胞沉淀的毫升数,即为本 斯值。根据本斯值判断酵母菌株的凝聚性强弱。
(三)发酵前后发酵液中还原糖含量的测定(DNS 法) 发酵前后发酵液中还原糖含量的测定( 酵液中还原糖含量的测定 本实验采用 DNS 法,利用可见光分光光度计,在 540 nm 波长下进行比测 定,测定酒样的光密度值,确定番茄酒中总糖含量,操作简捷,杂
质干扰少。 酶活的定义:1 mL 酶液于上述条件下,1min 内产生 1?mol 葡萄糖量的酶量 定义为 1 个酶活力单位“IU”。 1) 标准曲线的绘制 本实验采用3, 5-二硝基水杨酸比定糖法(DNS)。 测定酶解液中还原糖含量, 按表1进行葡萄糖标准曲线溶液配置,用分光光度计540 nm下进行比测定,用 空白管溶液调零后,测定各管光密度值,以葡萄糖浓度为横坐标,光密度值为纵 坐标,绘制标准曲线,用回归方程计算出相应的葡萄糖含量。 表1 葡萄糖标准曲线溶液配置表 Table1 Preparation of solution for glucose standard curve 项 目 空白 0 0 2.0 1.5 1 0.2 0.2 1.8 1.5 2 0.4 0.4 1.6 1.5 3 0.6 0.6 1.4 1.5 4 0.8 0.8 1.2 1.5 5 1.0 1.0 1.0 1.5 6 1.2 1.2 0.8 1.5 7 1.4 1.4 0.6 1.5 8 1.6 1 .6 0.4 1.5 含糖总量(mg) 葡萄糖液(mL) 蒸馏水(mL) DNS 试剂(mL) 加热 冷却 蒸馏水定容 沸水浴加热10 min 立即用流水冷却 定容至25 mL 2)发酵前后发酵液中还原糖含量的测定 取 5ml 糖化液进行过滤,滤液用 pH4.6 的醋酸盐缓冲液进行稀释,大约稀 释 10 倍。 取甲、 乙两支试管, 甲试管加入 1ml 稀释的糖化液, 乙管加入 1mlpH4.6 的缓冲液,分别加入 2mlpH4.6 的醋酸盐缓冲液和 2mlDNS 试剂。混匀后沸水浴 加热 5min,立即冷却定容到 5ml。混匀分别于 540nm 处比,用乙管调零,测 3 次,记录光密度值。然后在标准曲线上查得相应的还原糖含量 G mg。再由下 式计算样品中还原糖的含量: 还原糖含量(mg/mL)= Ga 式中: a 一稀释倍数 G 一还原糖量(mg)
(四)酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定 原理: 原理:糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖 或葡萄糖,包括淀粉-1,4-麦芽糖苷酶(β-淀粉酶)、淀粉-1,4-葡萄糖糖苷酶 (糖化酶) 和淀粉-1, 6-葡萄糖苷酶 (异淀粉酶) 本实验的研究对象是淀粉 α-1, 。 4-葡萄糖苷酶,它有催化淀粉水解的作用,从淀粉分子非还原性末端开始,分解 α-1,4-糖苷键生成葡萄糖,反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定,以表示糖化 性淀粉酶的活力。 碘量法原理: 碘量法原理:淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖,葡萄糖具有还原性,其羰基易 被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。 I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI 体系中加入过量的碘,氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的 碘,则可计算出酶的活力。防喷网 I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 仪器: 仪器:吸管(25ml、10ml、5ml、2ml)定碘瓶;碱式滴定管;恒温水浴锅;分 析天平。 试剂: 试剂: (1)2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉 2g(预先 100℃烘干约 2h 至恒重),用少量蒸馏水调匀, 徐徐倾入巳沸的蒸馏水中,煮沸至透明,冷却定容至 l00ml,此溶液需当天配制。 (2)0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722,用蒸馏水溶解,定容至 100m1。冰醋 酸(CH3COOH)1.17m1 定容至 100ml。分别取醋酸钠 49ml 和醋酸 51ml 混
匀。缓 冲液以酸度计或精密试纸校正 pH。 (3)20%氢氧化钠溶液 (4)0.1mol/L 碘液 称取碘化钾 35g 和碘 13g 溶解在 100m1 蒸馏水中, 定容至 1000ml 贮存于棕防辐射屏 瓶中。 (5)0.1mo1/L 氢氧化钠溶液 称取 4g 氢氧化钠加蒸馏水溶解,定容至 1000ml。 (6)1mol/L 硫酸溶液 量取浓硫酸 5.6ml,慢慢加入于 80 m1 蒸馏水中,冷却后定容至 l00ml,摇匀。 (7)0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液 配制:称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g 和碳酸钠约 0.2g(硫代 硫酸钠溶液在 pH9-10 时最稳定)溶于煮沸后冷却的蒸馏水中(无 CO2),定容 至 1000ml,即得 0.1 mol/L 硫代硫酸钠溶液。贮于棕瓶中密封保存,配制后应 放置一星期标定使用。
实验步骤: 1.待测酶液的制备 . 取发酵液的滤液用 pH4.6 醋酸钠缓冲液适当稀释,供测定用。 2.酶活力的测定 . 于甲、 乙两支管中, 分别加入 2%可溶性淀粉溶液 25m1 及 0.2mol/L pH4.6 的乙酸缓冲液 5ml,摇匀,在 40℃的恒温水浴中预热 5-10min,在甲管中加入待 测酶液 2ml(酶活总量约 100-170 单位),乙管中加 2ml 蒸馏水作对照,摇匀,立 即记时。准确反应 1h 后,取出各加 20%NaOH 溶液 0.2m1 终止酶反应,冷却至 室温。 取上述反应液 5m1 放入碘量瓶中,准确加入 0.1mol/L 碘液 10ml,再加入 0.1mol/L 氢氧化钠 15ml,摇匀后暗处放置 15min。加入 1mol/L 硫酸 2m1,用 0.05mol/L 硫代硫酸钠滴
定至无为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差 值应在 4~6 之间,否则要适当调整酶液的稀释倍数。 计算: 计算: 糖化酶活力单位的定义:在 40℃、pH4.6 的条件下,1 小时水解可溶性淀粉 产生 1 毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。 酶活力单位=(A-B)N ×90.05 ×(1/2) ×(32.2/5) ×n 式中 : A——空白所消耗硫代硫酸钠体积(ml); B——样品所消耗硫代硫酸钠体积(ml); N——硫代硫酸钠浓度(0.1mol/L); 90.05 ——1ml l mol/L 硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质(mg); 1/2 ——折算成 1m1 酶液的量 32.2——反应液总体积(ml) 5 ——吸取反应液样品的体积(ml); n ——酶液稀释倍数。 注意事项: 注意事项:ip调度系统 1)酶液制备时,酶液浓度最好控制在消耗 0.05mol/L 硫代硫酸钠(空白和样品) 的差数为 3~6ml 左右(以每毫升约 50~90 单位为宜)。 2)配制碘液时碘先和碘化钾溶解,溶解完全后再稀释。