用于鉴别诊断猪肠道冠状病毒引起腹泻性病原基因引物组合物及应用

1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因的引物组合物及应用。

背景技术：

2.猪病毒性腹泻是严重危害养猪业的重要传染病之一，每年都引发大量仔猪腹泻、迅速脱水死亡，且常因多种腹泻病毒混合感染而使病情加重，导致高死亡率，造成严重的经济损失。猪肠道冠状病毒是引起猪病毒性腹泻的病原之一，主要包括猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪轮状病毒(porv)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)、猪德尔塔冠状病毒(pdcov)等。
3.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrheavirus，ped)由pedv引起的一种急性、高度接触性传染病，各种日龄和品种的猪都易感，其中2周龄以下仔猪的致死率可达100％。断奶猪和育肥猪患病后出现4-6天水样腹泻。由于该病病程短，传播快，致使该病在全世界的传播非常广泛。
4.传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis ofswine virus，tgev)在各种时间段及品种的猪均易感，患猪主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水，该病在世界各国均有发生，给世界养猪业带来了极大的经济损失。
5.猪急性腹泻综合征冠状病毒(porcine acute diarrhea syndrome coronavirus，sads-cov)为最新发现的猪冠状病毒，可引起新生仔猪严重的急性腹泻，呕吐和脱水，最终因体重急剧减轻而导致死亡。5日龄以内的仔猪病死率可达到90％以上，感染率记录表明pedv(78.25％)为猪腹泻的主要原因，sads-cov感染率居第二位(43.53％)，在猪中有明显流行的趋势，也是造成养猪业重大经济损失的主要病原之一。
6.猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,pdcov)是肠道冠状病毒，临床表现为水样腹泻和呕吐，迅速脱水，衰竭而亡。各阶段猪均可感染，新生哺乳仔猪最易感染，发病率达50％～100％，死亡率高达100％。
7.猪轮状病毒(porcine rotavirus,porv)属呼肠病毒科，轮状病毒属。猪轮状病毒是引起仔猪病毒性腹泻常见的病原之一，主要临床症状表现为黄水样腹泻并伴随着呕吐,因该病流行范围广，发病率高，给养猪业带来了极大的经济损失。
8.目前针对猪病毒性腹泻的检测试剂盒主要是以传统单个荧光定量pcr检测方法为主，高通量检测病毒性腹泻病原效率更高，更便捷。

技术实现要素：

9.本发明提供一种用于鉴别诊断冠状病毒引起猪腹泻病原的引物组和物及其应用。具体通过以下技术方案实现：
10.所述用于检测猪流行性腹泻病毒m基因的引物组合物，其特征在于，包括以下引
物：
11.f3引物为seq id no.1所示的核苷酸序列；
12.b3引物为seq id no.2所示的核苷酸序列；
13.fip引物为seq id no.3所示的核苷酸序列；
14.bip引物为seq id no.4所示的核苷酸序列；
15.lf引物为seq id no.5所示的核苷酸序列；
16.lb引物为seq id no.6所示的核苷酸序列；
17.f3(seq id no.1)：gcagcggcaaaaatacacc
18.b3(seq id no.2)：actggcgatctgggcatag
19.fip(seq id no.3):
20.cgcccttgggaattctcctcc-acaaatccagagccacttcg
21.bip(seq id no.4)：
22.ggacccaggggaggcttcaa-cctgaggcatcaacacctt
23.lf(seq id no.5)：gatgtctttgaggtcacgttcttt
24.lb(seq id no.6)：tggagatgcggaatttgtcg
25.所述用于检测猪传染性胃肠炎病毒n基因的引物组合物，包括以下引物：
26.f3引物为seq id no.7所示的核苷酸序列；
27.b3引物为seq id no.8所示的核苷酸序列；
28.fip引物为seq id no.9所示的核苷酸序列；
29.bip引物为seq id no.10所示的核苷酸序列；
30.lf引物为seq id no.11所示的核苷酸序列；
31.lb引物为seq id no.12所示的核苷酸序列；
32.f3(seq id no.7)：gcgagtttcaacttgaagt
33.b3(seq id no.8)：tagaacgagagcgttgct
34.fip(seq id no.9):
35.gcctgcctctagattgagatctattaatcaagggacaattcaaggtta
36.bip(seq id no.10)：
37.aagaaggatgacagtgtagaacaaggttgtttttctgtgtaaacacc
38.lf(seq id no.11)：accgagatctagattgagagcg
39.lb(seq id no.12)：ctgttcttgccgcacttaaaaagt
40.所述用于检测猪德尔塔冠状病毒n基因的引物组合物，包括以下引物：
41.f3引物为seq id no.13所示的核苷酸序列；
42.b3引物为seq id no.14所示的核苷酸序列；
43.fip引物为seq id no.15所示的核苷酸序列；
44.bip引物为seq id no.16所示的核苷酸序列；
45.f3(seq id no.13)：ctgcatgggcactctcac
46.b3(seq id no.14)：accatatcctgtggcggatt
47.fip(seq id no.15):
48.ggtcgatgggaatgcacctccagtagactccttgcagggat
49.bip(seq id no.16)：
50.acaccagtcgttaagcatggcagatatgccattggccagct
51.所述用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒ns3基因引物组合物，包括以下引物：
52.f3引物为seq id no.17所示的核苷酸序列；
53.b3引物为seq id no.18所示的核苷酸序列；
54.fip引物为seq id no.19所示的核苷酸序列；
55.bip引物为seq id no.20所示的核苷酸序列；
56.lf引物为seq id no.21所示的核苷酸序列；
57.lb引物为seq id no.22所示的核苷酸序列；
58.f3(seq id no.17)：tggacttttccagttgaca
59.b3(seq id no.18)：gcaattctgccacgtctt
60.fip(seq id no.19):
61.tgcacttgttccctaataatagcttttgagggtgtcgttaactct
62.bip(seq id no.20)：
63.cctgctattaacggtgccaatatggttgaaggcttgtacaatgc
64.lf(seq id no.21)：ggtcaagtttagcagctctaatagt
65.lb(seq id no.22)：ctgggctatatgttgactagcatg
66.所述用于检测猪轮状病毒vp7基因的引物组合物，包括以下引物：
67.f3引物为seq id no.23所示的核苷酸序列；
68.b3引物为seq id no.24所示的核苷酸序列；
69.fip引物为seq id no.25所示的核苷酸序列；
70.bip引物为seq id no.26所示的核苷酸序列；
71.lf引物为seq id no.27所示的核苷酸序列；
72.lb引物为seq id no.28所示的核苷酸序列；
73.f3(seq id no.23)：acagcaacgtgtaccata
74.b3(seq id no.24)：acataatccaccactgtgtag
75.fip(seq id no.25):
76.tctaaaatattcgcgccgcctaccgcaactgtaaaaaattaggac
77.bip(seq id no.26)：
78.catcacagctgatccaacaactttgccaccattttttccaa
79.lf(seq id no.27)：gtatgactgctacattctcccttg
80.lb(seq id no.28)：accacagacagagagaatgatgc
81.所述的引物还包括将上述各f3、b3、fip、bip、lf和lb引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的dna分子。
82.本发明提供了上述引物组合物在环介导等温扩增方法中用以检测猪流行性腹泻病毒基因、猪传染性胃肠炎病毒基因、猪德尔塔冠状病毒基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒基因、猪轮状病毒基因的应用。
83.所述的引物组合物在环介导等温扩增(lamp)方法中，引物组合物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8：2-8范围。
84.所述的环介导等温扩增反应条件为60-65℃范围。
85.本发明还提供了上述组合物在用于引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因检测的试剂盒或芯片中的应用，具体为：
86.在制备检测猪流行性腹泻病毒基因、猪传染性胃肠炎病毒基因、猪德尔塔冠状病毒基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒基因、猪轮状病毒基因试剂盒和微流控芯片中的应用。包括将各条引物单独包装的步骤。
87.所述的试剂盒或芯片的检测步骤包括：
88.1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组cdna
89.2)以步骤1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物进行对猪流行性腹泻病毒基因、猪传染性胃肠炎病毒基因、猪德尔塔冠状病毒基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒基因、猪轮状病毒基因的环介导等温扩增。
90.本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有猪流行性腹泻病毒基因、猪传染性胃肠炎病毒基因、猪德尔塔冠状病毒基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒基因、猪轮状病毒基因。
91.应用上述引物组合物可以对样品中基因cdna模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有猪流行性腹泻病毒基因、猪传染性胃肠炎病毒基因、猪德尔塔冠状病毒基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒基因、猪轮状病毒基因；如果不可以对样品中基因cdna模版特异性扩增，则待测样品中不含有猪流行性腹泻病毒基因、猪传染性胃肠炎病毒基因、猪德尔塔冠状病毒基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒基因、猪轮状病毒基因。
92.本发明提供的用于检测猪流行性腹泻病毒基因、猪传染性胃肠炎病毒基因、猪德尔塔冠状病毒基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒基因、猪轮状病毒基因的引物组合物，可便捷、快速、准确的检测出结果。对于实际应用而言，能够在1小时内获得检测结果。
附图说明
93.图1是tgev扩增典型荧光曲线；
94.图2是tgev引物扩增pdev、porv、sads-cov、pdcov、猪基因组和空白对照荧光曲线；
95.图3是pdev扩增典型荧光曲线；
96.图4是pdev引物扩增tgev、porv、sads-cov、pdcov、猪基因组和空白对照荧光曲线；
97.图5是porv扩增典型荧光曲线；
98.图6是porv引物扩增tgev、pdev、sads-cov、pdcov、猪基因组和空白对照荧光曲线；
99.图7是sads-cov扩增典型荧光曲线；
100.图8是sads-cov引物扩增tgev、pdev、porv、pdcov、猪基因组和空白对照荧光曲线；
101.图9是pdcov扩增典型荧光曲线；
102.图10是pdcov引物扩增tgev、pdev、porv、sads-cov、猪基因组和空白对照荧光曲线；
具体实施方式
103.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本
发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
104.下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法；
105.下列实施中所用的试验材料，如无特殊说明，均为本领域常用的实验材料；
106.实施例1
107.利用人工合成含猪传染性胃肠炎病毒n基因的质粒，用以检测试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒。
108.将合成的质粒用作模板，反应体系如下表；
109.结果如图1、2所示，图1tgev质粒荧光曲线为特异s型曲线；图2pdev、porv、sads-cov、pdcov、猪基因组cdna和空白对照荧光曲线为基线。引物组合可以特异检测猪传染性胃肠炎病毒。
110.非洲猪瘟病毒荧光定量pcr反应管25ul反应体系：
[0111][0112][0113]
猪传染性胃肠炎病毒各引物的核苷酸序列如下：
[0114]
f3：gcgagtttcaacttgaagt
[0115]
b3：tagaacgagagcgttgct
[0116]
fip:
[0117]
gcctgcctctagattgagatctattaatcaagggacaattcaaggtta
[0118]
bip：aagaaggatgacagtgtagaacaaggttgtttttctgtgtaaacacc
[0119]
lf：accgagatctagattgagagcg
[0120]
lb：ctgttcttgccgcacttaaaaagt
[0121]
实施例2
[0122]
利用人工合成含猪流行性腹泻病毒m基因的质粒，用以检测试剂盒检测猪流行性腹泻病毒。
[0123]
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
[0124]
结果如图3、4所示，图3pdev质粒荧光曲线为特异s型曲线；图4tgev、porv、sads-cov、pdcov、猪基因组和空白对照荧光曲线为基线。引物组合可以特异检测猪流行性腹泻病毒。
[0125]
猪流行性腹泻病毒各引物的核苷酸序列如下：
[0126]
f3：gcagcggcaaaaatacacc
[0127]
b3：actggcgatctgggcatag
[0128]
fip:
[0129]
cgcccttgggaattctcctcc-acaaatccagagccacttcg
[0130]
bip：
[0131]
ggacccaggggaggcttcaa-cctgaggcatcaacacctt
[0132]
lf：gatgtctttgaggtcacgttcttt
[0133]
lb：tggagatgcggaatttgtcg
[0134]
实施例3
[0135]
利用人工合成含猪轮状病毒vp7基因的质粒，用以检测试剂盒检测猪轮状病毒。
[0136]
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
[0137]
结果如图5、6所示，图5porv质粒荧光曲线为特异s型曲线；图6tgev、pdev、sads-cov、pdcov、猪基因组和空白对照荧光曲线为基线。引物组合可以特异检测猪轮状病毒。
[0138]
猪轮状病毒各引物的核苷酸序列如下：
[0139]
f3：acagcaacgtgtaccata
[0140]
b3：acataatccaccactgtgtag
[0141]
fip:tctaaaatattcgcgccgcctaccgcaactgtaaaaaattaggac
[0142]
bip：catcacagctgatccaacaactttgccaccattttttccaa
[0143]
lf：gtatgactgctacattctcccttg
[0144]
lb：accacagacagagagaatgatgc
[0145]
实施例4
[0146]
利用人工合成含猪急性腹泻综合征病毒ns3基因的质粒，用以检测猪急性腹泻综合征病毒。
[0147]
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
[0148]
结果如图7、8所示，图7sads-cov质粒荧光曲线为特异s型曲线；图8tgev、pdev、porv、pdcov、猪基因组和空白对照荧光曲线为基线。引物组合可以特异检测猪急性腹泻综合征病毒。
[0149]
猪急性腹泻综合征病毒各引物的核苷酸序列如下：
[0150]
f3：tggacttttccagttgaca
[0151]
b3：gcaattctgccacgtctt
[0152]
fip：
[0153]
tgcacttgttccctaataatagcttttgagggtgtcgttaactct
[0154]
bip：
[0155]
cctgctattaacggtgccaatatggttgaaggcttgtacaatgc
[0156]
lf：ggtcaagtttagcagctctaatagt
[0157]
lb：ctgggctatatgttgactagcatg
[0158]
实施例5
[0159]
利用人工合成含猪德尔塔冠状病毒n基因的质粒，用以检测试剂盒检测猪德尔塔冠状病毒。
[0160]
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
[0161]
结果如图9、10所示，图9pdcov质粒荧光曲线为特异s型曲线；图10tgev、pdev、porv、sads-cov、猪基因组和空白对照荧光曲线为基线。引物组合可以特异检测猪德尔塔冠状病毒。
[0162]
猪德尔塔冠状病毒各引物的核苷酸序列如下：
[0163]
f3：ctgcatgggcactctcac
[0164]
b3：accatatcctgtggcggatt
[0165]
fip:
[0166]
ggtcgatgggaatgcacctccagtagactccttgcagggat
[0167]
bip：
[0168]
acaccagtcgttaagcatggcagatatgccattggccagct

技术特征：

1.一种用于检测引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因的引物组合物，所述的引物组合物用于检测猪流行性腹泻病毒m基因、猪传染性胃肠炎病毒n基因、猪德尔塔冠状病毒n基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒ns3基因、猪轮状病毒vp7基因的引物；所述用于检测猪流行性腹泻病毒m基因的引物组合物，其特征在于，包括以下引物：f3引物为seq id no.1所示的核苷酸序列；b3引物为seq id no.2所示的核苷酸序列；fip引物为seq id no.3所示的核苷酸序列；bip引物为seq id no.4所示的核苷酸序列；lf引物为seq id no.5所示的核苷酸序列；lb引物为seq id no.6所示的核苷酸序列；所述用于检测猪传染性胃肠炎病毒n基因的引物组合物，包括以下引物：f3引物为seq id no.7所示的核苷酸序列；b3引物为seq id no.8所示的核苷酸序列；fip引物为seq id no.9所示的核苷酸序列；bip引物为seq id no.10所示的核苷酸序列；lf引物为seq id no.11所示的核苷酸序列；lb引物为seq id no.12所示的核苷酸序列；所述用于检测猪德尔塔冠状病毒n基因的引物组合物，包括以下引物：f3引物为seq id no.13所示的核苷酸序列；b3引物为seq id no.14所示的核苷酸序列；fip引物为seq id no.15所示的核苷酸序列；bip引物为seq id no.16所示的核苷酸序列；所述用于检测猪急性腹泻综合症冠状病毒ns3基因引物组合物，包括以下引物：f3引物为seq id no.17所示的核苷酸序列；b3引物为seq id no.18所示的核苷酸序列；fip引物为seq id no.19所示的核苷酸序列；bip引物为seq id no.20所示的核苷酸序列；lf引物为seq id no.21所示的核苷酸序列；lb引物为seq id no.22所示的核苷酸序列；所述用于检测猪轮状病毒vp7基因的引物组合物，包括以下引物：f3引物为seq id no.23所示的核苷酸序列；b3引物为seq id no.24所示的核苷酸序列；fip引物为seq id no.25所示的核苷酸序列；bip引物为seq id no.26所示的核苷酸序列；lf引物为seq id no.27所示的核苷酸序列；lb引物为seq id no.28所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种用于检测引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因的引物组合物，其特征在于，所述的组合物包括将f3、b3、fip、bip、lf和lb引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的dna分子。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因的引物组合物，其特征在于，在环介导等温扩增方法中用以检测猪流行性腹泻病毒m基因、猪传染性胃肠炎病毒n基因、猪德尔塔冠状病毒n基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒ns3基因、猪轮状病毒vp7基因。4.根据权利要求3所述的一种用于检测引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物在环介导等温扩增方法中，引物组合物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8：2-8。5.根据权利要求3所述的一种用于检测引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因的引物组合物，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应条件为60-65℃恒温60min。6.根据权利要求1所述的一种用于检测引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因的引物组合物，其特征在于，在制备检测猪流行性腹泻病毒m基因、猪传染性胃肠炎病毒n基因、猪德尔塔冠状病毒n基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒ns3基因、猪轮状病毒vp7基因试剂盒和基因芯片中的应用。7.一种权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，在用于引起猪腹泻的肠道冠状病毒基因检测的试剂盒或芯片中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒和芯片的检测步骤包括：1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组rna；2)以步骤(1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物进行对猪流行性腹泻病毒m基因、猪传染性胃肠炎病毒n基因、猪德尔塔冠状病毒n基因、猪急性腹泻综合症冠状病毒ns3基因、猪轮状病毒vp7基因rna反转录和环介导等温扩增。

技术总结

本发明公开了一种用于鉴别诊断猪冠状病毒性腹泻病原的引物组和物及其应用，属于生物技术领域。包括以下引物：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB。本发明可用于鉴别诊断引起猪腹泻的冠状病毒病原基因，还能区分是哪种冠状病毒。本发明提供的引物组合物检测引起猪腹泻的冠状病毒基因具有灵敏度好、特异性高、用时短、稳定性高等特点。稳定性高等特点。