阿尔茨海默病动物模型的构建方法、用途和Aβ42重组表达载体

阿尔茨海默病动物模型的构建方法、用途和a
β
42重组表达载体
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及阿尔茨海默病动物模型的构建方法、用途和aβ42重组表达载体。

背景技术：

2.阿尔茨海默病(ad)是一种神经退行性疾病，在老年人中较为常见。阿尔茨海默病患者临床表现为认知功能下降、精神以及运动能力出现障碍，生活能力逐渐下降；其病理特征主要表现为胞外沉积形成淀粉样蛋白斑块、胞内聚集产生的神经纤维缠结，这些斑块和缠结的异常积累导致大脑中神经元的丢失以及胶质细胞的激活增生。当淀粉样前体蛋白或者早老素发生突变时，会改变淀粉样前体蛋白的分泌酶水解途径，导致aβ42的过度产生和积聚，aβ42是淀粉样蛋白沉积形成所必须的单体肽，因此aβ42的异常积累被认为是引发ad的级联反应的起点。
3.目前尚没有阿尔茨海默病的有效手段或药物，其中主要原因是缺乏合适的ad动物模型进行研究和药物的开发，因为aβ42的异常积累是驱动阿尔茨海默病的主要影响因素，因此构建在大脑中快速并稳定长期过表达aβ42的动物模型十分重要。
4.目前阿尔茨海默病的动物模型主要为转基因ad小鼠模型，主要包括 pdapp、tg2576、app23、tgcrnd8、psen1
m146v
或者psen1
m146l
、psapp、 app
dutch
、bri-aβ40和bri-aβ42、jnpl3、tau
p301s
、tau
v337m
、tau
r406w
、rtg4510、 htau、tapp、3
×
tgad等。
5.由于啮齿类动物无论是从体重、大脑结构、基因组相似度及生理生化等方面都与人类相差甚远，目前已报道的转基因ad小鼠模型不能很好地模拟ad病人的病理和行为特征，不适用于进行药物的研发筛选。
6.近年来越来越多的研究利用非人灵长类动物模型研究神经退行性疾病。已有研究通过向猕猴大脑的侧脑室连续注射aβ寡聚体，也会引起阿尔茨海默病样病理。然而，通过向猕猴大脑的侧脑室连续注射aβ寡聚体，虽然会引起阿尔茨海默病样病理，但是这种通过向侧脑室多次注射aβ寡聚体来构建ad动物模型的方法所需时间长，会引起急性反应，并且需要多次给药，不能很好地模拟aβ 在体内聚集。
7.因此，如何在动物大脑中快速并稳定长期过表达aβ42来模拟ad病人的病理特征是构建ad疾病动物模型以研究ad疾病的难点。

技术实现要素：

8.为了解决上述问题，本发明的第一目的在于提供一种阿尔茨海默病动物模型的构建方法，包括以下步骤：
9.通过立体定位注射方法将aβ42重组表达载体注射入非人灵长类动物脑部的海马区和前额叶皮层，aβ42重组表达载体为能够表达aβ42的aav载体。
10.本发明的一种实现方式中，非人灵长类动物为猴。
11.本发明的一种实现方式中，注射一个月后，海马区和前额叶皮层有因aβ42 聚集而形成的淀粉样蛋白斑块。
12.本发明的一种实现方式中，aβ42带有蛋白标签。
13.本发明的一种实现方式中，蛋白标签包括flag标签、ha标签和c-myc 标签中的至少一种。
14.本发明的一种实现方式中，注射时，aβ42重组表达载体的病毒滴度大于 10
12
vg/ml。
15.本发明的第二目的在于提供一种aβ42重组表达载体，包含aav载体，aav 载体含有bri-aβ42序列，bri-aβ42序列用于编码aβ42。
16.本发明的一种实现方式中，bri-aβ42序列连接有蛋白标签序列，蛋白标签序列用于编码蛋白标签。
17.本发明的一种实现方式中，蛋白标签包括flag标签、ha标签和c-myc 标签中的至少一种。
18.本发明的第三目的在于提供一种含有上述aβ42重组表达载体的转化体。
19.本发明的第四目的在于提供上述重组表达载体或者上述转化体在构建阿尔茨海默病动物模型中的用途。
20.本发明的一种实现方式中，动物为非人灵长类动物。
21.本发明的一种实现方式中，动物为猴。
22.本发明第五目的在于提供上述阿尔茨海默病动物模型的构建方法制得的阿尔茨海默病动物模型在筛选阿尔茨海默病的药物中的用途。
23.本发明公开的阿尔茨海默病动物模型的构建方法，通过一次注射即可实现非人灵长类动物体内长期表达aβ42，被表达的aβ42因其强大的毒性作用和容易发生聚集的特性，聚集形成淀粉样蛋白斑块，并使得激活的小胶质细胞数量增加，能在非人灵长类动物体内很好地模拟阿尔兹海默症病人的病理特征，可以用于阿尔兹海默症的大规模药物筛选。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为本发明实施例1中构建的两种质粒表达载体；
26.图2为本发明实施例1中构建的aav-ubc-bri-aβ42质粒表达载体的测序结果与aβ42基因序列对比示意图；
27.图3为本发明实施例2中免疫组织化学染鉴定结果示意图；
28.图4为本发明实施例2中蛋白免疫印迹验证鉴定结果示意图；
29.图5为本发明实施例3中注射目的病毒载体脑组织和野生型对照脑组织的 flag标签的免疫组化染结果示意图；
30.图6为本发明实施例3中注射目的病毒载体脑组织和野生型对照脑组织的淀粉样
斑块免疫组化染结果示意图。
31.图7为本发明实施例3中注射目的病毒载体脑组织和野生型对照脑组织的小胶质细胞免疫组化染结果示意图。
具体实施方式
32.现详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
33.因此，上述修改和变化旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
34.如上文，目前已报道的转基因ad小鼠模型不能很好地模拟ad病人的病理和行为特征，不利于进行药物的研发筛选。
35.通过向猕猴大脑的侧脑室连续注射aβ寡聚体，虽然会引起阿尔茨海默病样病理，但是这种通过向侧脑室多次注射aβ寡聚体来构建ad动物模型的方法所需时间长，会引起急性反应，并且需要多次给药，不能很好地模拟aβ在体内聚集。
36.为了解决上述问题的至少一个，本发明的第一方面提供了一种aβ42重组表达载体，包含aav载体，aav载体含有bri-aβ42序列，bri-aβ42序列用于编码aβ42。
37.本发明的aβ42重组表达载体是一种重组avv载体，其中，腺相关病毒 (adeno-associated virus，aav)是一类微小、无包膜的具有二十面体的细小单链dna病毒，重组aav载体是在非致病的野生型aav基础上改造而成的基因载体，能有效转染神经细胞。
38.如本文所用，术语“重组aav载体”、“重组aav载体”、“重组aav”、
ꢀ“
重组aav病毒”、“重组aav病毒粒”、“重组aav病毒颗粒”或“aav 基因表达载体”在本文中可以互换使用，其意指aav病毒衣壳包裹的基因组 dna中含有异源多核苷酸。
39.该载体是利用aav-ubc-gfp载体，将编码目的基因的序列替换编码gfp 的序列，通过感染、转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、内含子、kozak序列、目的基因、polya 序列、选择元件和报道基因。另外，载体还可以包含复制起点。
40.载体中bri是一种跨膜蛋白，其上有弗林蛋白酶切割位点，通过弗林蛋白酶的切割可以释放出aβ42。在动物实验中，在动物体内的弗林蛋白酶作用下， bri-aβ42就会被切割从而释放出aβ42。
41.本发明公开的aβ42重组表达载体，在体内能通过弗林蛋白酶的切割释放出 aβ42，被释放的aβ42因其强的毒性作用和容易发生聚集的特性，同样地聚集形成淀粉样蛋白斑块；给药次数少，通过一次注射即可实现非人灵长类动物体内长期表达aβ42，还能观察到更多的小胶质细胞被激活，在非人灵长类动物体内很好地模拟阿尔兹海默症病人的病理特征，用于阿尔兹海默症的大规模药物筛选。
42.一些实施方案中，bri-aβ42序列连接有蛋白标签序列，蛋白标签序列用于编码蛋白标签，用于区分内源性的aβ42。
43.一些实施方案中，蛋白标签包括flag标签、ha标签和c-myc标签中的至少一种。例如，aβ42重组表达载体含有bri-aβ42-flag序列或者bri-aβ42-ha 序列。需要说明的是，对于分子量较大的gfp标签，本发明将载体中的gfp替换为编码目的蛋白的基因，可以防止带有gfp的aβ42与实际的病人产生的 aβ42差异巨大，不能很好地模拟病人体内的aβ42，影响重组表达载体表达的 aβ42的切割、释放和聚集。
44.flag标签是一段由8个氨基酸残基组成的多肽：n-dykddddk-c(1012 da)，其作用是标记标签，编码标签的flag序列是： gattacaaggacgacgatgacaag。在蛋白表达和定位研究中，可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和flag基因序列连接起来，可以连接在目的蛋白的c端或n端，将整合后的基因转入细胞中，后续检测主要通过flag这段肽链形成的免疫决定簇与其单克隆抗体的特异性结合来实现，检测手段有免疫荧光(immunofluorescence)，免疫印记(western blotting)等。
45.一些具体实施方案中，aβ42重组表达载体含有启动子ubc，aβ42重组表达载体为aav-ubc-bri-bri-aβ42-flag。
46.在aav-ubc-bri-aβ42-flag表达载体中，bri-aβ42-flag的高表达是由ubc 转录子控制的。泛素(ub)是细胞内丰富且高度保守的蛋白质，泛素c启动子可用于在广泛的物种和组织类型中表达高水平蛋白，使用ubc启动子来启动 bri-aβ42-flag的转录，可以使bri-aβ42-flag在多个脑区以及多种细胞类型中实现高表达。
47.一些实施方案中，酶切位点包括限制性内切酶bamhⅰ和ecor
ⅴ
的酶切位点。
48.一些具体实施方案中，本发明的重组表达载体 aav-ubc-aav-ubc-bri-aβ42-flag是通过aav-ubc-gfp病毒表达载体改造而来，通过酶切位点bamhⅰ和ecor
ⅴ
删除aav-ubc-gfp质粒的gfp序列，并连接带有bamhⅰ和ecor
ⅴ
双酶切的bri-aβ42-flag序列，构建得到 aav-ubc-bri-aβ42-flag重组表达载体，用于表达aβ42。
49.载体中采用gfp上的克隆位点插入编码aβ42的序列，表达的aβ42不带 gfp，能够避免gfp影响aβ42的切割、释放和聚集。
50.具体地，本发明载体中采用gfp上的限制性内切酶bamhⅰ和ecor
ⅴ
的酶切位点删除aav-ubc-gfp病毒表达载体中的gfp序列，进一步采用bamh
ⅰꢀ
和ecor
ⅴ
的酶切位点连接bri-aβ42-flag序列，使得gfp上的克隆位点插入编码aβ42的序列，且表达的aβ42不带gfp，能够避免gfp影响aβ42的切割、释放和聚集。
51.本发明的第二方面提供了一种含有上述aβ42重组表达载体的转化体。
52.本发明的转化体用于对上述aβ42重组表达载体进行包装，并通过包装好的病毒对非人灵长类动物进行定位感染，进而实现在非人灵长类动物体内长期表达aβ42，并且能够聚集形成淀粉样蛋白斑块，flag标签可区分内源性的aβ42， aβ42的聚集还能使得激活的小胶质细胞数量增加，在非人灵长类动物体内很好地模拟阿尔兹海默症病人的病理特征。
53.一些实施方案中，转化体包括宿主细胞以及转化到宿主细胞的重组表达载体。
54.一些实施方案中，宿主细胞为大肠埃希氏杆菌细胞、hek293细胞、hela 细胞或vero细胞。
55.本发明的第三方面提供了一种上述aβ42重组表达载体的制备方法，包括：
56.用aav-ubc-gfp质粒上的bamhⅰ和ecor
ⅴ
两酶切位点将gfp序列删除，连接带有bamhⅰ和ecor
ⅴ
两酶切序列的bri-aβ42-flag序列，得到 aav-ubc-bri-aβ42载体。
57.aav-ubc-gfp病毒表达载体为常见的表达载体，为购自addgene公司。其中在这个表达载体中，泛素(ub)是细胞内丰富且高度保守的的蛋白质，泛素c 启动子可用于在广泛的物种和组织类型中进行高水平表达，选择ubc启动子来启动bri-aβ42-flag的转录，能够尽可能使bri-aβ42-flag在多个脑区以及多种细胞类型中高表达。
58.带gfp的aβ42与正常病理状态下的aβ42差异较大，会影响aβ42产生的毒性作用，本发明采用gfp上的克隆位点插入编码aβ42的序列，能够避免gfp 影响aβ42的切割、释放和聚集。
59.在ad病人体内，aβ42是通过对淀粉样前体蛋白2个阶段的剪切后产生的。首先，app的细胞外域被β-secretase切断，细胞外域片段被分泌出来。然后γ
ꢀ‑
secretase切断残留在细胞膜的app的c末端断片，并产生aβ42。病人体内通过β-secretase和γ-secretase切割产生的aβ42在胞外进一步发生聚集，形成淀粉样蛋白斑块。
60.本发明所构建的aav-ubc-bri-aβ42载体中，bri同样是一种跨膜蛋白，其上有弗林蛋白酶切割位点，通过弗林蛋白酶的切割可以释放出aβ42。在动物实验中，在动物体内的弗林蛋白酶作用下，bri-aβ42就会被切割从而释放出aβ42。
61.本发明用bri-aβ42-flag序列替换gfp序列得到的aβ42重组表达载体，具体地，aav-ubc-bri-aβ42载体在体内能通过弗林蛋白酶的切割释放出aβ42，被释放的aβ42因其强的毒性作用和容易发生聚集的特性，同样地聚集形成淀粉样蛋白斑块，从而起到模拟ad病人体内积聚淀粉样蛋白斑块的效果。
62.一些具体实施方案中，bri-aβ42序列为：
63.cgcggatccgccaccatggactacaaagacgatgacgacaagatggtgaaggtgacgttcaactccg ctctggcccagaaggaggccaagaaggacgagcccaagagcggcgaggaggcgctcatcatccccc ccgacgccgtcgcggtggactgcaaggacccagatgatgtggtaccagttggccaaagaagagcct ggtgttggtgcatgtgctttggactagcatttatgcttgcaggtgttattctaggaggagcatacttgt acaaatattttgcacttcaaccagatgacgtgtactactgtggaataaagtacatcaaagatgatgtca tcttaaatgagccctctgcagatgccccagctgctctctaccagacaattgaagaaaatattaaaatct ttgaagaagaagaagttgaatttatcagtgtgcctgtcccagagtttgcagatagtgatcctgccaac attgttcatgactttaacaagaaacttacagcctatttagatcttaacctggataagtgctatgtgatcc ctctgaacacttccattgttatgccacccagaaacctactggagttacttattaacatcaaggctggaa cctatttgcctcagtcctatctgattcatgagcacatggttattactgatcgcattgaaaacattgatca cctgggtttctttatttatcgactgtgtcatgacaaggaaacttacaaactgcaacgcagagaaacta ttaaaggtattcagaaacgtgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaa ttggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgt tgtcatagcgtgagatatcgc。
64.本发明的第三方面提供了一种上述重组表达载体或者上述转化体在构建阿尔茨海默病动物模型中的用途。具体地，含有上述aβ42重组表达载体的转化体能够在非人灵长类动物体内长期稳定表达aβ42，aβ42因其强大的毒性作用和容易发生聚集的特性，聚集形成淀粉样蛋白斑块。
65.一些实施方案中，动物包括非人灵长类动物。非人灵长类动物在大脑结构、大脑
体积、大脑重量等各方面都与人类更为接近，与传统的啮齿类等小动物相比，更能模拟阿尔兹海默症病人的病理特征。
66.一些具体实施方案中，动物包括猴，更具体地包括食蟹猴。
67.本发明的第五方面提供了一种阿尔茨海默病动物模型的构建方法，通过立体定位注射方法将bri-aβ42重组表达载体注射入非人灵长类动物脑部的脑海马区和前额叶皮层，bri-aβ42重组表达载体为能够表达aβ42的aav载体。
68.需要说明的是，海马体和前额叶皮层是ad较早且较易发生病变和损伤的脑区，海马区位于脑部的深处，难以确定其准确位置，本发明利用磁共振扫描图像(mri)对海马区和前额叶部位进行立体定位，以确定注射位置。
69.此外，海马形状较细长，前额叶皮层面积较广，病毒扩散覆盖面积有限，本发明采用多点注射的方式在脑海马区和前额叶皮层注射aav-ubc-bri-aβ42 重组表达载体，从而在注射区域过表达aβ42，过表达的aβ42在注射区域聚集，从而形成阿尔兹海默症病人的病理特征。
70.本发明的非人灵长类动物表达aβ42的方法简便快速，注射一个月后，受试动物就可出现阿尔兹海默症病人的病理特征，并且只需对受试动物进行一次立体定位注射，注射部位附近就可出现类似于阿尔兹海默症病人的病理特征，包括aβ42聚集形成的淀粉样蛋白斑块，以及更多的小胶质细胞被激活。
71.一些实施方案中，非人灵长类动物为猴。
72.一些具体实施方案中，非人灵长类动物为食蟹猴。
73.一些实施方案中，注射一个月后，海马区和前额叶皮层有因aβ42聚集而形成的淀粉样蛋白斑块。
74.一些具体实施方案中，aβ42带有蛋白标签，用以对aβ42或者聚集的aβ42 进行定位并区别内源性aβ42。
75.具体地，可以通过免疫组化染检测aβ42重组表达载体表达的aβ42及flag 标签，并观察aβ42是否聚集形成淀粉样蛋白斑块。
76.一些具体实施方案中，蛋白标签包括flag标签、ha标签和c-myc标签中的至少一种。
77.一些实施方案中，注射时，aβ42重组表达载体的病毒滴度为10
13
vg/ml，以实现aβ42重组表达载体在注射区域的过表达，使得aβ42聚集形成淀粉样蛋白斑块，以及使得更多的小胶质细胞被激活，从而形成阿尔兹海默症病人的病理特征，起到模拟ad病人体内积聚淀粉样蛋白斑块以及激活的小胶质细胞数量增加的效果。
78.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
79.实施例1重组表达载体的构建
80.本实施例使用的aav-ubc-gfp质粒为购自addgene，货号为plasmid #62518，限制性核酸内切酶bamhⅰ和ecor
ⅴ
购自美国new england biolabs公司。
81.构建表达目的质粒的病毒载体如图1，具体构建流程方法如下：
82.1.用aav-ubc-gfp质粒上的bamhⅰ和ecor
ⅴ
两酶切位点将gfp序列删除，连接带有bamhⅰ和ecor
ⅴ
两酶切序列的bri-aβ42-flag序列，得到 aav-ubc-bri-aβ42载体。
83.2.用aav-ubc-gfp质粒上的bamhⅰ和ecor
ⅴ
两酶切位点将gfp序列删除，连接带有
bamhⅰ和ecor
ⅴ
两酶切序列的bri-flag序列，得到 aav-ubc-bri载体。
84.改造后的aav质粒载体通过测序结果验证了质粒载体构建成功，具体结果见图2，图2为aav-ubc-bri-aβ42质粒表达载体的测序结果与aβ42基因片段序列的对比示意图。
85.实施例2在293t水平上验证所构建质粒的有效性及病毒的包装
86.将aav-ubc-bri-aβ42及aav-ubc-bri质粒分别转染至293t，48小时后收取细胞分别进行免疫组织化学染及蛋白免疫印迹验证，鉴定结果如图3及图4所示。
87.对在293t中验证表达有效性的aav-ubc-bri-aβ42及aav-ubc-bri质粒进行病毒包装。
88.实施例3动物模型的构建及病理学的检测
89.将实施例2中包装好的病毒通过立体定位注射方法注射入猴脑海马和前额叶部位。具体注射方案为：通过核磁共振扫描图像(mri)对猴脑海马和前额叶部位进行立体定位，参数以mri实际测量为准。随后在猴右侧海马及前额叶皮层注射20ul的aav-ubc-bri-aβ42，左侧海马及前额叶皮层注射20ul的 aav-ubc-bri(aav-ubc-bri-aβ42病毒滴度为10
13
vg/ml，aav-ubc-bri病毒滴度为10
13
vg/ml)。
90.待病毒注射1个月后，将注射后的猴子麻醉后灌流取出海马体和前额叶皮层进行免疫组化染。由于所构建的aav-ubc-bri-aβ42-flag载体带有flag 标签，flag抗体的免疫组化染显示在注射部位附近有大面积的细胞表达病毒载体，结果如图5所示。在病毒注射区，观察到典型的淀粉样斑块的形成，检测结果如图6所示，并且观察到激活的小胶质细胞数量增加，检测结果如图7 所示。
91.根据图4和图5可知，本发明采用立体定位注射方法将携带有表达bri-a β42-flag的病毒载体注射入受试食蟹猴的大脑海马体和前额叶层，注射1个月后，对受试猴的病理学检测发现被注射区域附近的aβ42的表达量明显增加，以及被激活的小胶质细胞数量增加。
92.本实施例公开的aav-ubc-bri-aβ42-flag载体，在体内能通过弗林蛋白酶的切割释放出aβ42，被释放的aβ42因其强烈的毒性作用和容易发生聚集的特性，同样地聚集形成淀粉样蛋白斑块，并且能够区分内源性的aβ42；给药次数少，给药后短期内即可模拟阿尔兹海默症病人的病理特征，通过一次注射即可实现非人灵长类动物体内长期表达aβ42并且形成聚集体，以及使得更多的小胶质细胞被激活，在非人灵长类动物体内很好地模拟阿尔兹海默症病人的病理特征，用于阿尔兹海默症的大规模药物筛选。
93.本发明建立的阿尔茨海默病动物模型的构建方法，采用立体定位多点注射的方式，在非人灵长类动物的海马体和前额叶层快速注射 aav-ubc-bri-aβ42-flag载体，简单快捷，给药次数少，一次给药即可实现在非人灵长类动物脑中快速并稳定长期过表达aβ42；出现病理特征的周期短，给药后仅需一个月左右即可模拟阿尔兹海默症病人的病理特征；进一步，本发明构建的阿尔茨海默病动物模型表达的aβ42由ubc启动子控制，可在不同细胞类型广泛表达aβ42并带有flag标签、ha标签和c-myc标签中的至少一种标签的，能够区别于内源性的aβ42，本发明构建的阿尔茨海默病动物模型可用于阿尔兹海默症的大规模药物筛选。
94.以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛
盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
95.以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：

1.一种阿尔茨海默病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：通过立体定位注射方法将aβ42重组表达载体注射入非人灵长类动物脑部的海马区和前额叶皮层，所述aβ42重组表达载体为能够表达aβ42的aav载体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人灵长类动物为猴。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，注射一个月后，所述海马区和所述前额叶皮层有因aβ42聚集物而形成的淀粉样蛋白斑块。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述aβ42带有蛋白标签。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白标签包括flag标签、ha标签和c-myc标签中的至少一种。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，在注射时，所述aβ42重组表达载体的病毒滴度大于10
12
vg/ml。7.一种aβ42重组表达载体，其特征在于，包含aav载体，所述aav载体含有bri-aβ42序列，所述bri-aβ42序列用于编码aβ42。8.根据权利要求7所述的aβ42重组表达载体，其特征在于，所述bri-aβ42序列连接有蛋白标签序列，所述蛋白标签序列用于编码蛋白标签。9.根据权利要求8所述的aβ42重组表达载体，其特征在于，所述蛋白标签包括flag标签、ha标签和c-myc标签中的至少一种。10.一种含有如权利要求7～9任一项所述的aβ42重组表达载体的转化体。11.权利要求7～9任一项所述的重组表达载体或者权利要求10所述的转化体在构建阿尔茨海默病动物模型中的用途。12.权利要求1～6任一项所述的阿尔茨海默病动物模型的构建方法制得的阿尔茨海默病动物模型在筛选阿尔茨海默病的药物中的用途。

技术总结

本发明涉及一种阿尔茨海默病动物模型的构建方法以及Aβ42重组表达载体，重组表达载体包含AAV载体，所述AAV载体含有BRI-Aβ42序列，所述BRI-Aβ42序列用于编码Aβ42。本发明公开的Aβ42重组表达载体在体内能通过弗林蛋白酶的切割释放出Aβ42，被释放的Aβ42因其强烈的毒性作用和容易发生聚集的特性，同样地聚集形成淀粉样蛋白斑块；本发明的阿尔茨海默病动物模型的构建方法造模时间短，通过一次注射即可实现非人灵长类动物体内长期表达Aβ42并聚集，使得激活的小胶质细胞的增加，并能在非人灵长类动物体内很好地模拟阿尔兹海默症病人的病理特征，用于阿尔兹海默症的大规模药物筛选。药物筛选。药物筛选。