水稻RLK突变体在促进植物生长或稻油轮作中的应用

水稻rlk突变体在促进植物生长或稻油轮作中的应用
技术领域
1.本发明属于农业技术领域，具体涉及osflr3或osflr11水稻突变体在促进植物生长或稻油轮作中的应用。

背景技术：

2.rlk亚家族catharanthus roseus rlk1-like(crrlk1l)的重要成员feronia(fer)，已被报道拟南芥中fer的突变(fer8)能富集有益微生物菌(如荧光假单胞杆菌)促进其他植物的生长，但是拟南芥因为fer的突变导致生长收到抑制。fer模块介导的免疫抑制能形成特殊的微生物菌缓解低磷胁迫。揭示了拟南芥在营养胁迫条件下通过调节机制来平衡植物的免疫应答、菌组成和矿物质吸收。
3.粮油安全是关系国计民生和长治久安之大事，稻油轮作制度是保障国家粮油安全的有效手段。水稻根系土壤与肥力息息相关，故研究根系土壤是稻油轮作制度下增产增效的基础。稻油轮作模式下，水稻根系菌调控土壤或作物养分高效利用，影响稻油轮作的生理机制研究已有极大进展，但促进稻油轮作的水稻优异基因资源还非常匮乏，未见相关报道。研究并利用促进稻油轮作的水稻优异基因资源增加油菜产量，充分发挥油菜养地增粮优势，为我国粮油安全带来基本保障。

技术实现要素：

4.本发明主要解决的技术问题是：如何利用基因工程手段编辑osflr3或osflr11基因影响获得水稻突变体参与稻油轮作，增加粮食产量。
5.osflr3或osflr11水稻突变体在促进植物生长的应用，osflr3基因分别在所述osflr3水稻突变体中的低表达或不表达；osflr11基因在所述osflr11水稻突变体中的低表达或不表达。
6.优选地，所述osflr3基因的核苷酸序列如seq id no.1；所述osflr11基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述osflr3基因编码的氨基酸序列分别为seq id no.3；所述osflr11基因编码的氨基酸序列为seq id no.4所示。
7.优选地，利用基因编辑手段来使osflr3基因在所述osflr3水稻突变体中的低表达或不表达；利用基因编辑手段来osflr11基因在所述osflr11水稻突变体中的低表达或不表达。
8.优选地，所述基因编辑是利用crispr/cas9基因编辑或干扰技术，对水稻osflr3或osflr11基因进行定点编辑。
9.优选地，所述crispr/cas9基因编辑技术的具体方法为：以水稻osflr3或osflr11基因为靶标，设计基于crispr/cas9的sgrna序列，将含有编码上述sgrna的dna片段连入crispr/cas9载体中转化水稻，实现对水稻osflr3或osflr11基因的定点编辑，得到osflr3或osflr11基因低表达或不表达的水稻品种；所述的osflr3或osflr11定点编辑的区域包括启动子、5
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utr、编码区及3
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utr。
10.优选地，所述osflr3基因的sgrna的核苷酸序列包括seq id no:6-7所示的一种；，所述osflr11基因的sgrna的核苷酸序列包括seq id no:10-11所示的一种。
11.优选地，所述植物为油菜。
12.osflr3或osflr11水稻突变体在稻油轮作中的应用，osflr3基因在所述osflr3水稻突变体中的低表达或不表达；osflr11基因在所述osflr11水稻突变体中的低表达或不表达。
13.优选地，所述osflr3或osflr11水稻突变体的获得方法为：利用crispr/cas9基因敲除系统构建靶点表达载体，采用农杆菌介导的方法将表达载体转化水稻愈伤组织，对osflr3或osflr11基因进行定点敲除，获得osflr3或osflr11水稻突变体；所述osflr3基因的核苷酸序列如seq id no.1；所述osflr11基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述osflr3基因编码的氨基酸序列分别为seq id no.3；所述osflr11基因编码的氨基酸序列为seq id no.4所示。
14.本发明以水稻osflr3或osflr11基因为靶标，设计了crispr/cas9的sgrna序列，将含有编码上述sgrna的dna片段连入crispr/cas9载体中，然后转化水稻，获得了水稻osflr3或osflr11基因的编辑材料，并发现其根系土壤对油菜生长具有明显的促进作用。
15.本发明人前期种植osflr3或osflr11突变体，发现生长状况与日本晴相似，没有受到明显影响。用osflr3或osflr11突变体根系土壤种植油菜，发现osflr3或osflr11突变体根系土壤促进油菜营养期生长。说明水稻类受体激酶osflr3或osflr11是影响水稻根系土壤参与稻油轮作的关键因子，获得并应用促进稻油轮作的水稻优异基因资源。
附图说明
16.图1为osflr3基因敲除植株与对照植株中编辑位点测序分析图。
17.图2为osflr11基因敲除植株与对照植株中编辑位点测序分析图。
18.图3为wt和水稻osflrs突变体营养期生长情况观察。
19.图4为wt和osflr3或osflr11突变体根系土壤对油菜生长促进作用。
20.图5为osflr3或osflr11突变体根系土壤对低营养油菜的恢复作用。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.一、室内试验
23.水稻生态型为日本晴；农杆菌菌种为eh105；载体pylcrispr/cas9p
ubi-h；主要试剂包括：thermo fisher生物公司的限制性内切酶、诺唯赞公司的dna聚合酶、infusion连接酶等；thermo公司的反转录试剂盒；天根公司的rna提取试剂盒；天根公司的质粒提取试剂盒以及dna回收试剂盒；taraka公司的定量pcr试剂；ms培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由北京擎科生物技术有限公司完成。
24.osflr3基因的核苷酸序列如seq id no.1；osflr11基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；osflr3基因编码的氨基酸序列分别为seq id no.3；osflr11基因编码的氨基酸序列为seq id no.4所示。
25.首先http://skl.scau.edu/，依据靶位点设计原则设计引物，最终选择osflr3基因中seq id no.5所示的序列作为sgrna的靶点：5
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gccctcctatcgattgcca-3’；选择osflr11基因中seq id no.9所示的序列作为sgrna的靶点：5
’‑
gacgctgaac cgcgccgag-3’。根据靶点设计引物，通过pcr、酶切、连接等方式，构建crispr/cas9的靶点载体。
26.sgrna序列如下：
27.osflr3-y1+:cagtggtctcaggcgccctcctatcgattgcca(seq id no.6)
28.osflr3-y1-:cagtggtctcaaaactggcaatcgataggagggc(seq id no.7)
29.osflr11-y1+:cagtggtctcaggcgacgctgaaccgcgccgag(seq id no.10)
30.osflr11-y1-:cagtggtctcaaaacctcggcgcggttcagcgtc(seq id no.11)
31.载体构建如下：
32.(1)退火：将上述引物的退火反应按照上海碧云天生物技术有限公司产品说明书(产品编号：d0251)，反应体系：5
×
annealing buffer for dna oligos 4μl，上下游引物各4μl(50μmol/μl)，nuclease-free water补至20μl；反应程序：95℃5min，每8s下降0.1℃，直至25℃；4℃保存；
33.(2)载体连接：将退火反应得到的dna产物连接到经过bsa i酶切过后的pylcrispr/cas9p
ubi-h载体上；连接体系：退火dna产物2μl，酶切pylcrispr/cas9p
ubi-h载体1.5μl，10
×
t4 dna ligase buffer 1μl，t4 dna ligase(400u/μl)0.5μl，无菌水补至10μl。连接产物转化dh5a感受态细胞，筛选阳性克隆；用上游引物：cagtggtctcgccctcctatcgattgcca(seq id no.6)或cagtggtctcaggcgacgctgaaccgcgccgag(seq id no.10)；下游引物：载体通用引物：atacgaagttatgactgcgaccga(seq id no.8)对菌斑进行菌落pcr；经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序验证；图1osflr3基因敲除植株与对照植株中编辑位点测序分析图。图2osflr11基因敲除植株与对照植株中编辑位点测序分析。
34.(3)表达载体农杆菌的转化和水稻遗传转化：将测序正确的pylcrispr/cas9p
ubi-h载体提取质粒后转化eh105农杆菌，在含卡那霉素和利福平抗性的yeb平板上进行筛选培养，挑取菌斑进行菌落pcr验证，将阳性的菌液扩繁培养，离心菌液，用ms液体培养基重悬菌体，然后用重悬液浸染水稻愈伤组织，将被侵染的愈伤组织在含有naa、6-ba和潮霉素的ms固体培养基中进行筛选，最终获得愈伤组织和通过抗性筛选的阳性小苗；基因编辑的植株经过自交繁种后获得t1代进行后续实验，为了防止再次发生突变，测序后可挑出突变体进行自交，去掉cas9背景，分别命名为osflr3或osflr11。
35.基因编辑材料根系土壤收集试验：水稻盆栽试验在湖南大学生物学院课题组温室内进行，水稻种植土壤来自湖大交叉研究院水稻田(113e,28.21n)。将水稻日本晴、osflr3、osflr11突变体种子用去离子水浸泡1d，播种在放有湿滤纸的培养皿中，置于37℃培养箱黑暗处理，催芽48h，至破胸露白，将秧苗移栽到混合均匀称重的土壤中，在光周期为12h光照(28℃)/12h黑暗(24℃)的生长箱生长6-7周。将第一代水稻日本晴、osflr3、osflr11突变体
植株地上部分剪掉，将同一基因型的剩余部分(包括根和土壤)完全混合在一个消毒容器中，晒干，放入新的干净的盆中(图3)，osflrs突变体与野生型水稻生长没有明显差异。
36.油菜盆栽试验：盆栽试验油菜苗期的培养在湖南大学生物学院课题组光照培养室中进行。光照培养室的温度设置为22℃，光照周期为14h(光照)/10h(黑暗)，光照强度为300-320μmol/m2/s，湿度为60-75％。选取大小一致的油菜种子，使用1％的naclo灭菌处理10min；将种子表面冲洗干净后，4℃下用灭菌超纯水(》18.25mω)浸泡24h。将浸泡过后的种子均匀播种到塑料育苗盘表面固定的纱布上，育苗盘中加适量超纯水。育苗3d后，将长势一致的幼苗移栽至装有不同基因型水稻根系土壤的盆中。并对油菜幼苗进行蒸压水浇水。将不同的材料并排置于同一生长室中，观察油菜营养期的生长指标变化(图4)。通过筛选发现osflr3突变体根系土壤对油菜生长的促进作用更加显著。说明水稻受体激酶osflr3或osflr11是影响稻油轮作的关键潜在因子。
37.油菜低营养处理试验：利用上述方法对油菜种子进行消毒，育苗。育苗3d后，将长势一致的幼苗移栽至珍珠岩上。该珍珠岩经过稀盐酸消毒清洗、过筛处理，每盆钵称取2kg。盆栽试验设置2个营养水平：缺大量元素和正常，每个水平处理下，每个基因型材料设置5个生物学重复。油菜的日常浇水均使用超纯水(》18.25mω)，观察油菜生长表型。水稻根系土壤恢复油菜低营养生长试验：将第一代水稻日本晴、osflrs3、osflrs11突变体种植在混合均匀称重的土壤中生长6-7周，将水稻植株拔出，收集根系土壤(包括根系)磨碎，浇灌种植在低营养珍珠岩上的油菜苗，观察油菜营养期的生长指标是否恢复。(结果见图5)，结果发现用osflr3或osflr11根系土壤恢复能力明显增强，油菜营养期株高和根长明显变长，鲜重明显增加。说明水稻类受体激酶osflr3或osflr11根系土壤促进油菜低营养胁迫下的生长。

技术特征：

1.osflr3或osflr11水稻突变体在促进植物生长的应用，其特征在于，osflr3基因分别在所述osflr3水稻突变体中的低表达或不表达；osflr11基因在所述osflr11水稻突变体中的低表达或不表达。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述osflr3基因的核苷酸序列如seq id no.1；所述osflr11基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述osflr3基因编码的氨基酸序列分别为seq id no.3；所述osflr11基因编码的氨基酸序列为seq id no.4所示。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用基因编辑手段来使osflr3基因在所述osflr3水稻突变体中的低表达或不表达；利用基因编辑手段来osflr11基因在所述osflr11水稻突变体中的低表达或不表达。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因编辑是利用crispr/cas9基因编辑或干扰技术，对水稻osflr3或osflr11基因进行定点编辑。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑技术的具体方法为：以水稻osflr3或osflr11基因为靶标，设计基于crispr/cas9的sgrna序列，将含有编码上述sgrna的dna片段连入crispr/cas9载体中转化水稻，实现对水稻osflr3或osflr11基因的定点编辑，得到osflr3或osflr11基因低表达或不表达的水稻品种；所述的osflr3或osflr11定点编辑的区域包括启动子、5
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utr、编码区及3
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utr。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述osflr3基因的sgrna的核苷酸序列包括seq id no:6-7所示的一种；所述osflr11基因的sgrna的核苷酸序列包括seq id no:10-11所示的一种。7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述植物为油菜。8.osflr3或osflr11水稻突变体在稻油轮作中的应用，其特征在于，osflr3基因在所述osflr3水稻突变体中的低表达或不表达；osflr11基因在所述osflr11水稻突变体中的低表达或不表达。

技术总结

本发明属于农业技术领域，具体涉及Osflr3或Osflr11水稻突变体在促进植物生长或稻油轮作中的应用，本专利的发明人发现Osflr3或Osflr11基因是影响水稻根系土壤参与稻油轮作的关键因子，获得并应用促进稻油轮作的水稻优异基因资源。通过CRISPR/Cas9技术定点编辑水稻中的Osflr3或Osflr11基因，并进一步通过自交去掉Cas9背景后遗传稳定性更强，定点编辑水稻材料对油菜生长具有良好的作用。稻材料对油菜生长具有良好的作用。

技术研发人员：

权利要求书1页说明书4页序列表10页附图2页

受保护的技术使用者：

湖南大学

技术研发日：

2022.06.22

技术公布日：

2022/11/18