寨卡病毒多肽的制作方法

寨卡病毒多肽
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年3月3日提交的美国临时申请序列号62/984,520的权益。在先申请的公开被认为是本技术的公开的一部分(并通过引用并入本技术的公开中)。
技术领域
3.本文件提供了与选定的寨卡病毒多肽相关的方法和材料。例如，本文件提供了疫苗组合物，其含有一种或多种本文提供的所选的寨卡病毒多肽，并且具有增加针对哺乳动物(例如，人)体内黄病毒如寨卡病毒的免疫应答的能力。

背景技术：

4.寨卡病毒(zikv)曾是一种不知名的病原体，已经成为全球性的公共卫生问题。自2007年以来，zikv病毒已经蔓延至整个太平洋和南美洲，导致2015-2016年期间广为人知的疫情(gatherer等人，《普通病毒学杂志(j.gen.virol.)》97:269-273(2016))。在美国大陆也报道了局部zikv传播，并且约60％的美国人口居住在允许伊蚊属蚊子媒介的季节性传播的地区。强有力的证据已将孕妇的zikv感染与许多胎儿畸形和神经系统异常联系起来，强调需要一种有效的疫苗来遏制这种新兴疾病的传播(krauer等人,《公共科学图书馆医学(plos med.)》14:e1002203(2017))。

技术实现要素：

5.本文件提供了与选定的寨卡病毒多肽相关的方法和材料。例如，本文件提供了表1、表2和表3中所示的分离的多肽。在一些情况下，本文提供的所选的寨卡病毒多肽可以是基本上纯的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成。本文件还提供了疫苗组合物，其含有一种或多种本文提供的所选的寨卡病毒多肽，并且具有增加针对哺乳动物(例如，人)体内黄病毒(如寨卡病毒)的免疫应答的能力；用于制备疫苗组合物的方法和材料，所述疫苗组合物含有一种或多种本文提供的所选的寨卡病毒多肽，并且具有增加针对哺乳动物(例如，人)体内黄病毒(如寨卡病毒)的免疫应答的能力；含有本文提供的一种或多种选择的寨卡病毒多肽的试剂盒；用于使用这类试剂盒来鉴定哺乳动物(例如，人)是否曾经或目前患有寨卡病毒感染的方法；以及用于使用这类试剂盒来鉴定哺乳动物(例如，人)是否具有特异性针对黄病毒(如寨卡病毒)的体液免疫的方法。
6.如本文所述，所选的寨卡病毒多肽被鉴定为具有诱导针对寨卡病毒的广泛回忆免疫应答的能力。
7.一般而言，本文件的一个方面的特征在于基本上纯的多肽，所述多肽基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成。所述多肽可以与选自由蔗糖、乳糖、谷氨酸的单钠盐、人血清白蛋白和明胶组成的组的稳定剂共价缀合。
8.在另一方面，本文件的特征在于一种包含至少四种多肽的组合物，其中所述至少
四种多肽中的每一种基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。所述至少四种多肽中的每一种都可以是由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。所述至少四种多肽中的每一种都可以是由seq id nos:1-9中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。所述组合物可以包含由seq id no:1中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:2中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:3中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:4中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:5中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:6中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序列组成的多肽，以及由seq id no:9中所示的氨基酸序列组成的多肽。所述组合物可以包含佐剂。所述佐剂可以选自由cpg寡核苷酸基序、硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、单磷酰脂a、磷酸铝、mf59、as03和as04组成的组。
9.在另一方面中，本文件的特征在于一种用于增加针对哺乳动物体内黄病毒的免疫应答的方法。所述方法包含基本上由以下组成或由以下组成，由向哺乳动物施用包含多肽的组合物，所述多肽基本上由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成。所述哺乳动物可以是人。所述黄病毒可以是寨卡病毒。所述组合物可以包含佐剂。所述佐剂可以选自由cpg寡核苷酸基序、硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、单磷酰脂a、磷酸铝、mf59、as03和as04组成的组。所述组合物可以包含至少四种多肽，其中所述至少四种多肽中的每一种基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。所述至少四种多肽中的每一种都可以是由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。所述至少四种多肽中的每一种都可以是由seq id nos:1-9中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。所述组合物可以包含由seq id no:1中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:2中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:3中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:4中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:5中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:6中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序列组成的多肽，以及由seq id no:9中所示的氨基酸序列组成的多肽。
10.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于实施本发明，但合适的方法和材料在下文描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
11.本发明的一个或多个实施例的细节在附图和下面的描述中阐述。本发明的其他特征、目标和优点将根据说明书和附图以及权利要求书变得明显。
附图说明
12.图1.ifn-γelispot分析集中于候选物多肽(左簇)和比较物多肽(右簇)的应答。示出了所有受试者的zikv反应以用于比较。sfu指斑点形成单位，并且代表通过分泌ifn-γ识别每种肽的t细胞的数量。
具体实施方式
13.本文件提供了与选定的寨卡病毒多肽相关的方法和材料。例如，本文件提供了表1、表2和表3中所示的分离的多肽。在一些情况下，本文提供的所选的寨卡病毒多肽可以是基本上纯的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成。如本文所用的涉及多肽的术语“基本上纯的”是指该多肽基本上不含与其天然相关联的其它多肽、脂质、碳水化合物和核酸。因此，基本上纯的多肽是从其天然环境中移除并且纯度至少为60％的任何多肽。基本上纯的多肽可以是至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的纯度。典型地，基本上纯的多肽将在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上产生单个主要条带。在一些情况下，本文提供的基本上纯的多肽可以是被合成为具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％纯度的多肽。
14.表1.示例性的寨卡病毒多肽
[0015][0016][0017]
表2.用作图1中的比较物多肽的示例性寨卡病毒多肽。
[0018]
多肽序列seq id no:用于图1的肽标识符grgpqrlpvp101alalaiiky112rqdqrgsgqvvty124tvtrnaglvkrr136ylipglqaa149ltvvvgsvknpmgrgpqrlpvpvn1513iipkslagplshhntregyrtq1615rgpqrlpvpvn1716
[0019]
在一些情况下，本文提供的基本上由seq id nos:1-17中的任一个所示的氨基酸序列组成的寨卡病毒多肽是这样的多肽，其在序列标识符(例如，seq id no:1)的铰接序列内具有零个、一个或两个氨基酸取代的，在序列标识符(例如，seq id no:1)的铰接序列之前具有零个、一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基，和/或在序列标识符(例如，seq id no:1)的铰接序列之后具有零个、一个、两个、三个、四个，或五个氨基酸残基，条件是寨卡病毒多肽具有增加针对哺乳动物(例如，人)体内黄病毒如寨卡病毒的免疫应答的能力。基本上由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的寨卡病毒多肽的实例在表3中所示。
[0020]
表3.示例性的寨卡病毒多肽。
[0021][0022][0023]
本文提供的多肽(例如，基本上纯的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)可以是任何合适的长度。例如，本文提供的
多肽(例如，基本上纯的多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)的长度可以是9个氨基酸残基至100个氨基酸残基(例如，9个氨基酸残基至90个氨基酸残基、9个氨基酸残基至80个氨基酸残基、9个氨基酸残基至70个氨基酸残基、9个氨基酸残基到60个氨基酸残基、9个氨基酸残基到50个氨基酸残基、9个氨基酸残基到40个氨基酸残基、9个氨基酸残基到35个氨基酸残基、9个氨基酸残基到30个氨基酸残基、9个氨基酸残基到25个氨基酸残基、9个氨基酸残基到24个氨基酸残基、9个氨基酸残基到23个氨基酸残基、9个氨基酸残基到22个氨基酸残基、9个氨基酸残基到21个氨基酸残基、9个氨基酸残基到20个氨基酸残基、9个氨基酸残基到19个氨基酸残基、9个氨基酸残基到18个氨基酸残基、9个氨基酸残基到17个氨基酸残基、9个氨基酸残基到16个氨基酸残基、9个氨基酸残基到15个氨基酸残基、10个氨基酸残基到100个氨基酸残基、11个氨基酸残基到100个氨基酸残基、12个氨基酸残基到100个氨基酸残基、13个氨基酸残基到100个氨基酸残基、14个氨基酸残基到100个氨基酸残基、15个氨基酸残基到100个氨基酸残基、16个氨基酸残基到100个氨基酸残基、17个氨基酸残基到100个氨基酸残基、18个氨基酸残基到100个氨基酸残基、19个氨基酸残基到100个氨基酸残基、20个氨基酸残基到100个氨基酸残基、21个氨基酸残基到100个氨基酸残基、22个氨基酸残基到100个氨基酸残基、23个氨基酸残基到100个氨基酸残基、24个氨基酸残基到100个氨基酸残基、25个氨基酸残基到100个氨基酸残基、10个氨基酸残基到80个氨基酸残基、10个氨基酸残基到50个氨基酸残基、10个氨基酸残基到30个氨基酸残基、10个氨基酸残基到25个氨基酸残基，或10个氨基酸残基到20个氨基酸残基)的长度。
[0024]
本文提供的多肽(例如，基本上纯的多肽，包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)可以具有增加针对哺乳动物(例如，人)体内黄病毒如寨卡病毒的免疫应答的能力。例如，在向哺乳动物(例如，人)施用本文提供的多肽(例如，基本上纯的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)或编码本文提供的多肽的核酸(例如，编码的多肽的核酸，所述核酸包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)后，该哺乳动物可以产生针对黄病毒如寨卡病毒的增加的免疫应答(例如，增加的抗体应答和/或增加的t细胞应答)。可以使用任何合适的方法来鉴定针对黄病毒如寨卡病毒的增加的免疫应答的发展。例如，本文提供的包括一种或多种本文提供的多肽的试剂盒可以用于评估从哺乳动物获得的样品，该样品被测试具有与这些多肽结合的能力的抗体的存在、不存在或水平。
[0025]
可以使用任何合适的方法来获得本文提供的多肽(例如，基本上纯的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)。例如，本文提供的多肽(例如，基本上纯的多肽，包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)可以通过从表达该多肽的细胞(例如，经工程改造以从编码该多肽的外源性核酸表达该多肽感兴趣的细胞或被病毒(例如，寨卡病毒)感染的细胞，其从该病毒表达感兴趣的多肽)中分离感兴趣的多肽或通过使用合适的固相肽合成技术合成感兴趣的多肽来获得，所述固相肽合成技术如在别处描述的那些(“肽合成简介(introduction to peptide synthesis)”.gregg b.fields.《蛋白质科学最新协议(current protocols in protein science)》.第26卷，第1期第18.1.1-18.1.9页(2001))。
[0026]
本文件还提供了编码本文提供的多肽(例如，多肽，所述多肽包含基本上由或由
seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)的核酸。例如，本文件提供了质粒和病毒载体，其包括以这样的方式编码本文提供的多肽(例如，多肽，包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)的核酸，使得该多肽可以在细胞内表达。在一些情况下，编码本文提供的多肽(例如，多肽，包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)的核酸可以包括调节核酸序列(例如，启动子序列)，其可操作地连接至多肽编码序列，使得多肽在细胞内表达。如本文所述可以使用的启动子序列的实例包括但不限于cmv启动子、ef1a启动子、sv40启动子、pgk1启动子、ubc启动子、cag启动子、四环素应答元件启动子和h1启动子。
[0027]
本文件还提供了组合物，其包括一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)本文提供的多肽和/或编码一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)本文提供的多肽的核酸。例如，本文提供的组合物可以包括表1中所示的至少四种(例如，四种、五种、六种、七种或八种)多肽(或编码这些多肽的核酸)。在一些情况下，本文提供的组合物可以包括表1中所示的每种多肽(或编码这些多肽的核酸)。在一些情况下，本文提供的组合物可以包括表2中所示的至少四种(例如，四种、五种、六种或七种)多肽(或编码这些多肽的核酸)。在一些情况下，本文提供的组合物可以包括表2中所示的每种多肽(或编码这些多肽的核酸)。可以用于制备本文提供的组合物的多肽的其它特定组合的实例包括但不限于表4中所示的那些。
[0028]
表4.多肽(或编码这些多肽的核酸)的示例性组合。
[0029][0030]
可以使用任何合适的方法来配制本文提供的组合物(例如，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种本文提供的多肽和/或编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种本文提供的多肽的核酸的组合物)。例如，本文提供的一种或多种多肽(和/或编码这类一种或多种多肽的核酸)可以与药学上可接受的载体和/或药物赋形剂组合。术语“药学上可接受的”是指通常无毒的、惰性的和/或生理上相容的化合物。术语“药物赋形剂”包括如载体、ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、着剂和防腐剂的材料。
[0031]
在一些情况下，本文提供的组合物(例如，包括一种或多种本文提供的多肽和/或编码一种或多种本文提供的多肽的核酸的组合物)可以是疫苗组合物。例如，含有seq id nos:1-9中所示的四种或更多种多肽的组合物可以被配制成用于哺乳动物(例如人)的基于多肽的疫苗。可以使用任何合适的方法来配制基于多肽的疫苗，如在别处描述的那些；
belyakov等人，《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》95:1709-1714(1998)；jackson等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》101:15440-15445(2004)；makarkov等人,《npj疫苗(npj vaccines)》,15(4):17(2019))；hekele等人,《新兴微生物和感染(emerg.microbes infect.)》2(8):e52(2013)；parlane等人.《生物化学和生物物理研究通讯(biochem.biophys.resmun.)》pii:s0006-291x(20)30264-3(2020)；和bounds等人,《人类疫苗免疫疗法(hum.vaccin.immunother.)》13(12):2824-2836(2017))。在一些情况下，本文提供的疫苗组合物可以包括与一种或多种佐剂组合的一种或多种本文提供的多肽(例如，四种或更多种不同的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)。可以包括在本文提供的疫苗组合物中的佐剂的实例包括但不限于cpg寡核苷酸基序、铝(如，铝盐，如硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾)、单磷酰脂a、硫酸羟基磷酸铝、mf59、as03、as04、cpg1018和aso1b。在一些情况下，包括在本文提供的疫苗组合物中的佐剂可以是非天然存在的(例如，人工的)佐剂。在一些情况下，本文提供的疫苗组合物可以包括本文提供的一种或多种多肽(例如，四种或更多种不同的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)，一种或多种佐剂，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或药物赋形剂。
[0032]
在一些情况下，本文提供的疫苗组合物的多肽可以与例如多糖(例如蔗糖或乳糖)、氨基酸(例如甘氨酸或谷氨酸的单钠盐)和/或蛋白质(例如人血清白蛋白或明胶)缀合，以改善疫苗组合物的稳定性或免疫原性。在一些情况下，本文提供的多肽可以与递送载体如纳米颗粒组合被配制成疫苗组合物。例如，本文提供的四种或更多种多肽可以被包括在纳米颗粒内(例如，嵌入或展示在纳米颗粒的表面上)。
[0033]
在一些情况下，本文提供的疫苗组合物可以是多价疫苗组合物，其具有增加针对哺乳动物(例如人)体内黄病毒家族的多个成员的免疫应答的能力。例如，本文提供的疫苗组合物可以具有增加针对寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒或其任意组合的免疫应答的能力。在一些情况下，本文提供的疫苗组合物可以用作多价疫苗组合物，其具有增加针对寨卡病毒的一种或多种谱系、分支或毒株的免疫应答的能力。例如，本文提供的疫苗组合物可以具有增加针对东非寨卡病毒、西非寨卡病毒、亚洲寨卡病毒、南美寨卡病毒或其任何组合的免疫应答的能力。
[0034]
本文件还提供了用于增加针对哺乳动物(例如，人)体内黄病毒如寨卡病毒的免疫应答的方法。例如，本文提供的疫苗组合物可以施用于哺乳动物(例如，人)以增加针对黄病毒如寨卡病毒的免疫应答(例如，增加的抗体应答和/或增加的t细胞应答)。任何合适的哺乳动物可以被施用本文提供的疫苗组合物，以增加针对该哺乳动物体内黄病毒如寨卡病毒的免疫应答。例如，人类、非人灵长类动物(例如，猴子或猿)、马、狗、猫、牛物种、猪、绵羊、小鼠、大鼠、山羊、鸭、水牛和蝙蝠可以被施用本文提供的疫苗组合物，以增加针对黄病毒如寨卡病毒的免疫应答。在一些情况下，被鉴定为需要增加针对黄病毒如寨卡病毒的免疫应答的哺乳动物可以被施用本文提供的疫苗组合物。例如，被鉴定为最近(例如，在一至两周内)与一个或多个患有或疑似患有黄病毒感染(例如，寨卡病毒感染)的人接触的人可以被鉴定为需要增加针对黄病毒如寨卡病毒的免疫应答，并且可以被施用本文提供的疫苗组合物。在一些情况下，正在旅行或计划旅行至怀疑具有流行的黄病毒感染(例如，寨卡病毒感染)或先前黄病毒感染(例如，寨卡病毒感染)暴发的地点的人可以被鉴定为需要增加针对黄病
毒如寨卡病毒的免疫应答，并且可以被施用本文提供的疫苗组合物。在一些情况下，怀孕的哺乳动物(例如，怀孕的人)可以被施用本文提供的疫苗组合物，以增加针对黄病毒如寨卡病毒的免疫应答。
[0035]
该文献还提供了用于被黄病毒如寨卡病毒感染的哺乳动物(例如人)的方法。例如，本文提供的疫苗组合物可以被施用于患有寨卡病毒感染的哺乳动物(例如，人)，以降低寨卡病毒感染的严重程度。任何合适的哺乳动物都可以被施用本文提供的疫苗组合物以黄病毒感染如寨卡病毒感染。例如，人类、非人灵长类动物(例如，猴子或猿)、马、狗、猫、牛物种、猪、绵羊、小鼠、大鼠、山羊、鸭、水牛和蝙蝠可以被施用本文提供的疫苗组合物以黄病毒感染如寨卡病毒感染。在一些情况下，怀孕的哺乳动物(例如，怀孕的人)可以被施用本文提供的疫苗组合物，以黄病毒感染如寨卡病毒感染。在一些情况下，被鉴定为患有黄病毒感染如寨卡病毒感染的哺乳动物可以被施用本文提供的疫苗组合物以该感染。可以使用任何合适的方法将哺乳动物鉴定为患有黄病毒感染如寨卡病毒感染。例如，免疫测定可以用于将哺乳动物(例如人)鉴定为具有针对黄病毒(例如寨卡病毒)特异性的抗体。在一些情况下，可以检测从哺乳动物获得的样品中黄病毒核酸(例如，寨卡病毒核酸)的存在，从而表明该哺乳动物患有黄病毒感染。如本文所述，可以从待测试和评估的哺乳动物获得任何合适的样品。例如，生物样品如流体样品(例如，血液(例如，全血、血浆和血清)、尿液、母乳、唾液、羊水、脑脊液或精液)或组织样品(例如，胎盘组织样品)可以从哺乳动物获得，并如本文所述进行评估。
[0036]
在一些情况下，本文提供的疫苗组合物可以在有效减少感染的一种或多种症状或疾病并发症的持续时间和/或严重程度的条件下，施用于患有黄病毒感染(例如，寨卡病毒感染)的哺乳动物(例如，人)。黄病毒感染的症状包括但不限于发热、皮疹(例如，斑丘疹性皮疹)、肌肉疼痛、关节痛、背痛、结膜炎、呕吐、头痛、不适、虚脱、四肢水肿、腹泻、厌食、头晕以及更严重的症状如黄疸、肾衰竭、全身性休克和死亡。
[0037]
当向哺乳动物(例如，人)施用本文提供的组合物(例如，疫苗组合物)时，可以使用任何合适的施用途径。例如，本文提供的组合物(例如，疫苗组合物)可以静脉内(例如，通过静脉注射或输注)、皮下(例如，通过皮下注射)、腹膜内(例如，通过腹膜内注射)、口服、通过吸入或肌内(例如，通过肌内注射)被施用于哺乳动物(例如，人)。在一些情况下，本文提供的组合物(例如，疫苗组合物)的施用途径和/或方式可以针对被的哺乳动物进行调整。
[0038]
本文提供的组合物(例如，疫苗组合物)的有效剂量可以根据施用途径、受试者的年龄和一般健康状况、赋形剂的使用、与其他性方法(如使用其它药剂)共同使用的可能性以及医师的判断而变化。在一些情况下，本文提供的组合物(例如，疫苗组合物)的有效量可以是增加针对哺乳动物(例如人)体内黄病毒如寨卡病毒的免疫应答而不对哺乳动物产生显著毒性的量。例如，本文提供的组合物(例如疫苗组合物)的有效量可以是约3μg/剂至约150μg/剂(例如3μg/剂至150μg/剂、5μg/剂至150μg/剂、10μg/剂至150μg/剂、15μg/剂至150μg/剂、20μg/剂至150μg/剂、25μg/剂至150μg/剂、30μg/剂至150μg/剂、3μg/剂至125μg/剂、3μg/剂至100μg/剂、3μg/剂至90μg/剂、3μg/剂至75μg/剂、10μg/剂至125μg/剂、15μg/剂至100μg/剂、15μg/剂至90μg/剂或20μg/剂至75μg/剂)。在一些情况下，本文提供的组合物(例如疫苗组合物)的有效量可以是组合物的总寨卡病毒多肽含量的约3μg至组合物的总寨卡病毒多肽含量的约150μg(例如，总寨卡病毒多肽含量的3μg至150μg、5μg至
150μg、10μg至150μg、15μg至150μg、20μg至150μg、25μg至150μg、30μg至150μg、3μg至125μg、3μg至100μg、3μg至90μg、3μg至75μg、10μg至125μg、15μg至100μg、15μg至90μg或20μg至75μg)，其中该总寨卡病毒多肽含量是组合物中所有多肽的总和，所述多肽包含基本上或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成。
[0039]
本文件还提供了含有一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)本文提供的多肽(例如，一种或多种基本上纯的多肽，所述多肽包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成)的试剂盒。例如，本文提供的试剂盒可以包括表1中所示的至少四种(例如，四种、五种、六种、七种或八种)多肽。在一些情况下，本文提供的试剂盒可以包括表1中所示的每种多肽。在一些情况下，本文提供的试剂盒可以包括表2中所示的至少四种(例如，四种、五种、六种或七种)多肽。在一些情况下，本文提供的试剂盒可以包括表2中所示的每种多肽。
[0040]
在一些情况下，本文提供的试剂盒可以用于检测哺乳动物(例如人)内的免疫应答(例如，体液抗体应答或细胞免疫应答)。例如，可以将从哺乳动物(例如人)获得的细胞与本文提供的试剂盒一起孵育，所述试剂盒包括呈现本文提供的一种或多种多肽的抗原呈递细胞，以检测具有识别在试剂盒中包括的一种或多种多肽的能力的抗原特异性t细胞的存在或不存在。在一些情况下，1}本文提供的试剂盒可以用于检测哺乳动物(例如，施用本文提供的疫苗组合物的哺乳动物)接种后的抗原特异性t细胞，以确定免疫的效力。在一些情况下，本文提供的试剂盒可以用于检测hla-ii类限制性t辅助细胞，其具有识别试剂盒中包括的一种或多种多肽的能力。可以使用任何合适的技术来确定具有识别本文提供的试剂盒中包括的一种或多种多肽的能力的细胞的存在与不存在(例如，t细胞，如hla-ii类限制性t辅助细胞)。例如，流式细胞术、酶联免疫斑点(elispot)、细胞因子分泌、直接细胞毒性测定和淋巴细胞增殖测定可以用于检测抗原特异性t细胞。在一些情况下，细胞因子的产生和/或脱颗粒可以用作标志物，以确定具有识别本文提供的试剂盒中包括的一种或多种多肽的能力的细胞的存在与不存在(例如，t细胞，如hla-ii类限制性t辅助细胞)。可以评估的细胞因子的实例包括但不限于干扰素γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素2il-2)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素5(il-5)、白细胞介素10(il-10)、干扰素α(ifn-α)、转化生长因子β(tgf-β)、白细胞介(il-12)和白细胞介素17(il-17)。可以评估的脱颗粒标记物的实例包括但不限于穿孔素的细胞内表达、颗粒酶b的细胞内表达或cd107a的细胞表面表达。在一些情况下，本文提供的试剂盒可以包括用荧光染料标记(例如，共价标记)的mhc-多肽四聚体形式的一种或多种本文提供的多肽。在这类情况下，本文提供的试剂盒的标记的mhc-多肽四聚体可以用于与样品中的抗原特异性t细胞结合，并且可以通过流式细胞术对结合的细胞进行计数。
[0041]
如本文所述，本文提供的方法和材料可以用于增加针对哺乳动物(例如人)体内黄病毒的免疫应答，可以用于被黄病毒感染的哺乳动物(例如人)，可以用于鉴定具有黄病毒感染的哺乳动物(例如人)，和/或可以用于鉴定具有针对黄病毒的免疫应答哺乳动物(例如人)(例如，体液抗体应答或细胞免疫应答)。这类黄病毒的实例包括但不限于寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、斯庞德温尼病毒(spondweni virus)、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒(st.louis encephalitis virus)、波瓦桑病毒(powassan virus)、蜱传播脑炎病毒(tick borne encephalitis virus)、科萨努尔森林病毒
(kyasanur forest virus)、鹿蜱病毒(deer tick virus)、鄂木斯克出血热病毒(omsk hemorrhagic fever virus)、恩德培病毒(entebbe viruses)、摩多克鼠病毒(modoc viruses)和里奥布拉伏病毒(rio bravo viruses)。当黄病毒是寨卡病毒时，寨卡病毒可以是寨卡病毒的任何合适的谱系、分支或毒株。这类寨卡病毒的实例包括但不限于东非寨卡病毒、西非寨卡病毒、亚洲/太平洋寨卡病毒和亚洲/美国寨卡病毒。
[0042]
本发明将在以下实例中进一步描述，这些实例并不限制权利要求中描述的本发明的范围。
[0043]
实例
[0044]
实例1：针对寨卡病毒的基于肽的疫苗开发
[0045]
在本实例中，表达hla-a*0201和hla-drb1*0401的永生化人b细胞用zikv感染，并且使用酸性缓冲液使细胞表面上的hla分子变性来分离多肽。通过二维(2d)液相谱法耦合串联质谱法(lc-ms/ms)来鉴定多肽。随后使用一套计算方法来分析多肽，以评估抗原特性和与不同hla分子的结合。使用合成多肽来筛选来自康复期的受试者的免疫细胞中的ifn-γt细胞应答。
[0046]
通过质谱法的多肽鉴定
[0047]
hla-a*02:01(a2超型)和hla-drb1*04:01(dr4超型)纯合的永生化b细胞用zikv(prvabc59,moi＝0.1)感染，并培养48小时，以允许病毒蛋白的充分加工和呈递。用酸性柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(ph＝3.0)处理细胞以使hla分子变性，并通过离心过滤从蛋白质污染物中分离多肽。使用强阳离子交换(scx)谱法通过分馏进一步纯化多肽，并通过纳米级液相谱串联质谱法(nlc-ms/ms)进行分析。用uniprot进行的去卷积分析鉴定了90种来自病毒蛋白的多肽：59种来自非结构(ns)蛋白1(ns1)，2种来自ns2a，7种来自ns3，4种来自ns4b，8种来自ns5，8种来自衣壳(c)，以及2种来自包膜(e)。具有高度序列相似性的冗余序列或多肽(例如，嵌套在较大序列中的序列)被排除在进一步分析之外，将列表缩小至34种用于测试的独特多肽。以大批量(5mg)单独地合成多肽用于功能测试。
[0048]
康复期的受试者
[0049]
使用来自7名先前记录有zikv感染的健康人供体的外周血单核细胞(pbmc)。受试者在本文中通过其独特的数字研究标识符来表示:591、596、602、625、626、627和629。受试者591在感染后的两个不同日期提供了样品：约21天和约138天。这些样品随后分别被表示为591-1和591-3。
[0050]
ifn-γt细胞elispot回忆应答
[0051]
多肽池刺激
[0052]
将病毒多肽随机分类到8-9个多肽的池中，在相邻的池之间具有重叠。将pbmc(2x105个细胞/孔)接种到涂有抗人ifn-γ抗体的96孔的聚偏二氟乙烯(pvdf)支持的微量滴定板中，并且用下列条件之一处理：培养基(未刺激的)、20μg汇集的zikv多肽、zikv(moi＝1)或20μg汇集的肌动蛋白多肽作为阴性对照。将细胞孵育18小时，并且使用人ifn-γelispot试剂盒定量回忆免疫应答。数据也按受试者分组，以更好地可视化每个个体独有的回忆应答概况。用zikv多肽或活病毒刺激的样品以一式三份进行测试；未刺激的样品和阴性对照以一式四份进行测试。应答在多肽池和个体受试者之间高度可变，并且在至少一名受试者中刺激阳性ifn-γelispot应答的池随后在个体多肽水平上针对有应答的受试者进
行分析。
[0053]
个体多肽刺激
[0054]
将pbmc(2x105个细胞/孔)接种在涂有抗人ifn-γ抗体的96孔的pvdf支持的微量滴定板中，并且用下列条件之一处理：培养基(未刺激的)、10μg单独的zikv肽、zikv(moi＝1)或20μg汇集的肌动蛋白多肽作为阴性对照。将细胞孵育18小时，并且使用人ifn-γelispot试剂盒定量回忆免疫应答。用zikv多肽或活病毒刺激的样品以一式三份进行测试；未刺激的样品和阴性对照以一式四份进行测试。在7名受试者中的4名(表1)中，选择了刺激阳性回忆免疫应答的九种多肽作为详细信息学分析的主要zikv衍生多肽。选择了刺激有限回忆应答的八种多肽(7名受试者中有1名；表2)作为比较物。
[0055]
多肽结构和特性的建模
[0056]
使用pep-fold 3.5(一种基于序列中每个氨基酸的特性预测多肽结构的在线服务器)对seq id nos:1-9中所示的所有zikv衍生多肽和比较物多肽的结构进行建模。使用在expasy服务器上托管的protparam工具在计算机上确定两组中单独的多肽的特性。在seq id nos:1-9中所示的多肽在很大程度上被预测为具有在生理条件下建模时采用某种程度螺旋构象的有序结构。相比之下，大多数比较物多肽(8个中的5个)采用了在相同建模参数下表现出高度卷曲和延伸结构特征的大部分无序结构。预计seq id nos:1-9中所示的zikv衍生的多肽比对照物组具有更长的理论半衰期(16.21小时相对于8.99小时)，这与两组的平均不稳定性指数(24.72相对于43.75)相关。较大的不稳定性指数(》40)表明多肽结构不稳定。还预测了seq id nos:1-9中所示的zikv衍生的多肽具有比对照物组更大的平均脂肪族指数(125.41相对于103.67)，这是热稳定性的阳性指标。亲水性(gravy)指数的总体平均值在seq id nos:1-9中所示的zikv衍生的多肽和比较物组之间存在差异(0.27相对于-0.24)，表明比较物多肽稍微更亲水。多肽稳定性可以用于设计基于多肽的疫苗和剂，并且总的来说，这些建模数据表明seq id nos:1-9中所示的zikv衍生的多肽对于配制和用作zikv疫苗的组分是稳定的。
[0057]
优化的ifn-γelispot回忆应答
[0058]
ifn-γelispot回忆应答的分析被修改为仅集中于seq id nos:1-9和比较物多肽中所示的zikv衍生的多肽簇。如所预期的，在康复期的受试者中，在seq id nos:1-9中所示的zikv衍生的多肽中观察到引发回忆应答的密集多肽簇，而比较物簇在受试者中表现出非常窄的应答概况。受试者602和625是比较物组中最强的应答者，其中受试者625对8个表位中的4个表位有应答(图1)。三名受试者(626、596和629)对比较物组中的任何多肽无应答。相反，所有受试者都对seq id nos:1-9中所示的zikv衍生的多肽中的至少三种多肽表现出回忆应答，这说明了由seq id nos:1-9中所示的zikv衍生的多肽提供的覆盖范围。
[0059]
其它实施例
[0060]
应当理解，虽然已经结合本发明的具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都在以下权利要求书的范围内。

技术特征：

1.一种基本上纯的多肽，所述多肽基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的基本上纯的多肽，其中所述多肽与选自由蔗糖、乳糖、谷氨酸的单钠盐、人血清白蛋白和明胶组成的组的稳定剂共价缀合。3.一种包含至少四种多肽的组合物，其中所述至少四种多肽中的每一种是基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述至少四种多肽中的每一种是由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述至少四种多肽中的每一种是由seq id nos:1-9中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含由seq id no:1中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:2中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:3中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:4中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:5中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:6中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序列组成的多肽，以及由seq id no:9中所示的氨基酸序列组成的多肽。7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含佐剂。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述佐剂选自由cpg寡核苷酸基序、硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、单磷酸脂a、磷酸铝、mf59、as03和as04组成的组。9.一种用于增加针对哺乳动物的黄病毒的免疫应答的方法，其中所述方法包含向所述哺乳动物施用一种组合物，所述组合物包含基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物是人。11.根据权利要求9至10中任一项所述的方法，其中所述黄病毒是寨卡病毒。12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述组合物包含佐剂。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述佐剂选自由cpg寡核苷酸基序、硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、单磷酸脂a、磷酸铝、mf59、as03和as04组成的组。14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少四种多肽，其中所述至少四种多肽中的每一种是基本上由或由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少四种多肽中的每一种是由seq id nos:1-17中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少四种多肽中的每一种是由seq id nos:1-9中的任一个中所示的氨基酸序列组成的多肽。17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，其中所述组合物包含由seq id no:1中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:2中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:3中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:4中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:5中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:6中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序列组成的多肽、由seq id no:7中所示的氨基酸序
列组成的多肽，以及由seq id no:9中所示的氨基酸序列组成的多肽。

技术总结

本文件提供了与选定的寨卡病毒多肽相关的方法和材料。例如，提供了疫苗组合物，其含有本文提供的一种或多种选择的寨卡病毒多肽，并且具有增加针对哺乳动物(例如，人)体内的黄病毒如寨卡病毒的免疫应答的能力。毒如寨卡病毒的免疫应答的能力。

技术研发人员：

格雷戈里

受保护的技术使用者：

梅奥医学教育和研究基金会

技术研发日：

2021.03.01

技术公布日：

2022/11/22