第2期收稿日期：2008－11－15
基金项目：国家科技支撑计划项目“文化遗产保护关键技术研究”（2006BAK20B02）作者简介：尹
娟（1984－），女，湖南宁乡人，在读硕士研究生，（电话）132****7799（）wanzhongyi＠sohu．com ；通讯作者，杨自文，研究员，博士，（电话）************（）zwy＠public．wh．hb．cn 。
细菌纤维素是由某些微生物在含糖基质上发酵产生的一类超微纤维素，是由吡喃葡萄糖残基以 β－1，4糖苷键连接而成的链状高分子聚合物。与自然
界存在的植物纤维素相比，细菌纤维素有更多优良的特性，如高纯度、高结晶度、较高的机械强度和很好的亲水性，并易于在环境中降解。细菌纤维素作为一种新兴的生物材料，在食品工业、生物医学、造纸工业、石油开采等方面都有广泛的用途。在国外，如日本、美国，已经得到了较好的应用。目前国内对细菌纤维素还处于研究阶段，实现产业化的技术障碍主要是发酵水平低。在能够产细菌纤维素的细菌中，木醋杆菌是研究得比较深入的菌种，发酵产细
菌纤维素的能力较强，有较好的应用前景。因此本项研究选择木醋杆菌
1．1812
（Acetobacter xylinum 1．1812）
作为研究对象，旨在优化培养基，确定初始发酵条件及通过不同培养方式的比较提高细菌纤维素的产量。 1
材料与方法
1．1
材料
1）菌种木醋杆菌1．1812（Acetobacter xylinum 1．1812），
购自中国普通微生物菌种保藏中心。
2）培养基配方斜面培养基：葡萄糖10％，酵
母提取物1％，CaCO 32％，琼脂1．5％，pH 值6．8，120℃
细菌纤维素发酵技术初步研究
尹
娟1，2，万中义2，周荣华2，王开梅2，杨自文2
（1．中国科学院武汉病毒研究所，武汉
430061；
2．湖北省生物农药工程研究中心／湖北农业科技创新中心生物农药分中心，武汉
430064）
摘要：以木醋杆菌
1．1812
为出发菌株，通过单因素和正交试验，优化了木醋杆菌产细菌纤维素的发酵培养
基及发酵条件。优化后的发酵培养基组成为葡萄糖8％，酵母提取物2％，柠檬酸0．3％，Na 2HPO 4·12H 2O 0．2％，KH 2PO 40．1％，MgSO 4·7H 2O 0．02％，乙醇1％；发酵条件为培养基初始pH 值5．4，装液量为500mL 摇瓶中装100mL 发酵液，发酵方式为静置培养。经验证，使用优化后的
培养基配方，在上述发酵条件下，30℃培养6d ，细菌纤维素的产量可达0．633g ·100mL －1。关键词：发酵培养基；细菌纤维素；木醋杆菌1．1812
中图分类号：TQ920．1
文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）02－0435-03
Optimization of Medium and Conditions for Fermentation Process of Bacterial
Cellulose
YIN Juan 1，2，WAN Zhong－yi 2，ZHOU Rong－hua 2，WANG Kai－mei 2，YANG Zhi－wen 2
（1．Wuhan Institute of Virology ，Chinese Academy of Sciences ，Wuhan 430061，China ；2．Hubei Biopesticide Engineering Research Center ／
The Branch Center of Biopesticide ，Hubei Agricultural Science Innovation Center ，Wuhan 430064，China ）
Abstract ：Using Acetobacter x ylinum 1．1812as primary strain ，the single factor and orthogonal
experiments were designed to optimize fermentation media ，conditions of producing bacterial cellulose and find out a proper way of fermentation to produce more bacterial cellulose．The optimized media was obtained as follows ：glucose 8％，yeast extract powder 2％，citric acid
0．3％，Na 2HPO 4·12H 2O 0．2％，KH 2PO 40．1％，MgSO 4·7H 2O 0．02％，alcohol 1％，and the proper fermentation condition as follows ：
pH5．4，static culture at 30℃for 6days．The yield is 0．633g ·100mL －1．Key words ：fermentation medium ；bacterial cellulose ；Acetobacter xylinum 1．1812
第48卷第2期2009
年
2
月湖北农业科学
H ubei A gricultural S ciences
Vol．48No.2Feb ．，2009
湖北农业科学2009年
灭菌20min。液体种子培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，柠檬酸0．2％，Na2HPO4·12H2O0．27％，MgSO4·7H2O0．03％，pH值6．8，121℃灭菌20min。优化后的发酵培养基：葡萄糖8％，酵母提取物2％，柠檬酸0．3％，Na2HPO4·12H2O0．2％，KH2PO40．1％，MgSO4·7H2O0．02％，乙醇1％，pH值5．4，121℃灭菌20min。1．2方法
1．2．1培养方法将制备好的种子液接入液体培养基，用装液量为100mL的摇瓶发酵，30℃，150r·min－1摇床或静置培养，6d后测纤维素干重。1．2．2发酵培养基优化
1）单因素试验确定适宜的碳源、氮源和有机酸基础发酵培养基配方为碳源5％，氮源1％，有机酸0．1％，Na2HPO4·12H2O0．27％，KH2PO40．1％，MgSO4·7H2O0．025％，pH值6．8，121℃灭菌20min。其中碳源分别为葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖＋蔗糖（1∶1）、葡萄糖＋果糖（1∶1）和果糖＋蔗糖（1∶1）；氮源分别为蛋白胨、酵母提取物和胰蛋白胨；有机酸分别为柠檬酸、醋酸和乳酸。接种量为8％，装液量为500mL的摇瓶装100mL的发酵液，30℃，150r·min－1摇床培养6d后终止发酵，测定发酵终点的pH值和纤维素干重。3次重复。确定碳源、氮源、有机酸的种类时，分别固定氮源为蛋白胨，有机酸为柠檬酸；碳源为葡萄糖，有机酸为柠檬酸；碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨。
2）正交试验确定最佳培养基配比单因素试验确定适宜的碳源、氮源和有机酸后，以Na2HPO4·12H2
O、KH2PO4和MgSO4·7H2O为无机盐，添加乙醇作为增效因子，进行L18（37）正交试验。
1．2．3发酵条件优化
1）发酵液初始pH值的确定用优化后的培养基，装液量为500mL摇瓶装100mL的发酵液，调节初始pH值分别为5．4、6．0和6．8。以8％的接种量转入发酵培养基中，30℃静置培养。6d后终止发酵，测纤维素干重。
2）装液量的确定用优化后的培养基配方，装液量分别为500mL的摇瓶中装50mL、100mL和150mL的发酵液，将种子液以8％的接种量接入上述培养基，30℃，静置培养。6d后终止发酵，测纤维素干重。
3）培养方式的确定用优化后的培养基配方，以8％的接种量接入上述优化后的培养基，装液量为500mL的摇瓶装100mL的发酵液，30℃，150r·min－1摇床培养。从发酵开始的第一天起，每天从摇床上取出3瓶静置培养。6d后终止发酵，测纤维素干重。1．2．4细菌纤维素干重测定用纱布过滤除去纤维素中的培养基并用去离子水反复洗涤。将纤维素悬于1％的NaOH溶液，100℃保温30min以除去菌体。用去离子水连续洗涤纤维素至中性。纤维素在80℃烘干，冷却至室温后称量。
2结果与分析
2．1单因素试验结果与分析
由表1数据可知，单独以葡萄糖为碳源时纤维素产量较高。木醋杆菌能够直接利用葡萄糖合成纤维素。果糖和蔗糖转化成葡萄糖后才能被木醋杆菌作为合成纤维素的前体物质。以酵母提取物作为氮源时纤维素的产量较高。柠檬酸有利于纤维素的合成。因此选定葡萄糖为碳源，酵母提取物为氮源，柠檬酸为有机酸，进行正交试验。
2．2正交试验结果与分析
正交试验因素水平和结果见表2、表3。由表3知，7个因素对纤维素产量影响的主次顺序为A＞D＞C＞F＞E＞B＞G，即培养基各成分对纤维素产量的影响顺序为葡萄糖＞KH2PO4＞Na2HPO4·12H2O＞柠檬酸＞MgSO4·7H2O＞酵母提取物＞乙醇。
由方差分析结果可知，除G因素外，其他因素对细菌纤维素产量影响显著，显著性大小顺序为A＞D＞C＞F＞E＞B，即培养基各成分对纤维素产量的影响顺序为葡萄糖＞KH2PO4＞Na2HPO4·12H2O＞柠檬酸＞MgSO4·7H2O＞酵母提取物，与极差分析所得结果一致。正交试验中纤维素产量最高的为第18组试表2正交试验各因素对应水平表
水
平
1
2
3
葡萄糖
（A）
2%
5%
8%
酵母提取
物（B）
1%
2%
3%
Na2HPO4·12H2O
（C）
0.1%
0.2%
0.3%
omap4460KH2PO4
（D）
0.1%
0.2%
0.3%
MgSO4·7H2O
（E）
0.01%
0.02%
0.03%
www.hgnc
柠檬酸
（F）
0.1%
0.2%
0.3%
乙醇
（G）
0%
1%
2%
因素
表1单因素试验结果
培养基
A
B
C
D
E
F
纤维产量（相对值）
5
——
—
—
1．7
2．5
培养基
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
X
Y
Z
纤维产量（相对值）
2．5
4．2
促进剂cbs
3．2
2．5
—
2．4注：A～F为确定碳源的培养基，Ⅰ～Ⅲ为确定氮源的培养基，X～Z 为确定有机酸的培养基。“—”表示纤维素产量很低，烘干后无法在分析天平上测出，“――”表示不产纤维素。
436
第2期
验，结合表2，各因素的水平为A3B3C2D1E2F3G1。通过极差分析得到的理论上纤维素产量最高的培养基配方各因素水平为A3B2C2D1E2F3G2。极差分析所得的理论上纤维素产量最高的培养基配方不包括在正交试验设计的18组试验中，但与其中的第18组各水平相差不大，除B因素和G因素外，其他各因素的水平相同。而B因素和G因素对纤维素产量影响不大。因此，在实际中，较优培养基配方可以选择的各因子水平为A3B3C2D1E2F3G1或A3B2C2D1E2F3G2。因此得到的较优培养基配方为葡萄糖8％，酵母提取物2％，柠檬酸0．3％，Na2HPO4·12H2O0．2％，KH2PO4 0．1％，MgSO4·7H2O0．02％，乙醇1％，pH值6．8，121℃灭菌20min。
2．3发酵条件对细菌纤维素产量的影响
2．3．1发酵液初始pH值对纤维素产量的影响发酵液初始pH值取5．4时，纤维素的产量为100mL 产14.7g，比pH值6.0、pH值6.8都高。木醋杆菌适宜在酸性环境中生长，在发酵开始的前2天细胞大量增多，从第3天开始产生大量纤维素。若发酵初始pH值太高或太低都不利于前期细胞数量增多，导致发酵后期纤维素产量低。
2．3．2装液量对纤维素产量的影响从重复试验的平均值（表4）可知，装液量越大，单位体积发酵液纤维素产量越低。装液量为500mL的摇瓶装100 mL发酵液时，纤维素的产量与装液量为500mL的摇瓶装50mL发酵液的产量相差不大。在实际操作过程中，因为发酵周期较长，50mL的发酵液在500mL的摇瓶中比表面积较大，不停地振荡使发酵液中的水分容易蒸发从而影响发酵结果，一般摇床发酵选择的装液量为500mL的摇瓶装100mL发酵液。静置发酵因为水分不容易散失可以选择装液量为500mL的摇瓶装50mL发酵液。
2．3．3培养方式对纤维素产量的影响比较各种培养方式（表5）可知，静置培养可使纤维素的产量显著提高。振荡产生的剪切力可以使木醋杆菌变异，失去产纤维素的能力。静置培养无剪切力，产生的纤维能够较好地聚集成一完整的胶质膜。悬于气液交界表面的胶质膜有利于大量的附着于膜中的菌体吸收氧气。因此，合适的方式为静置培养。
2．3．4验证试验结果使用优化后的培养基配方（葡萄糖8％，酵母提取物2％，柠檬酸0．3％，Na2H
PO4·12H2O0．2％，KH2PO40．1％，MgSO4·7H2O0．02％，乙醇1％），在pH值5．4，接种量8％，装液量为500mL 的摇瓶中装100mL的发酵液（实际用100mL和50 mL两种装液量验证），30℃静置培养6d。结果装液量为500mL的摇瓶中装50mL的发酵液时，木醋杆菌发酵产细菌纤维素最平均产量可达0．518g·50mL；装液量为500mL的摇瓶中装100mL的发酵液时，木醋杆菌发酵产细菌纤维素最平均产量可达0．633g·100mL－1。
3小结
本项研究中，通过单因素试验，确定了最适合木醋杆菌产细菌纤维素的碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸粉，经过正交试验，确定木醋杆菌最适配方为葡萄糖8％，酵母提取物2％，柠檬酸0．3％，Na2HPO4·12H2O0．2％，KH2PO40．1％，MgSO4·7H2O 0．02％，乙醇1％。经过进一步试验，确定最适合木醋
表3正交试验结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
3
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
C
1
2
3
1
2
3
2
3
1
3
1
2
2
3
1
3
1
2
D
1
2
3
2
3
1
1
2
3
3
1
2
3
1
2
2
3
1
E
1
2
3
2
3
1
3
1
2
2
3
1
1
2
3
3
1
2
F
1
2
3
3降膜吸收塔
1铂钛催化剂
2
2
3
1
2
3
1
3
1
2
1
2
3
G
1
2
3
3
1
2
3
1
2
1
2
3
2
3
1
2
3
1
纤维产量（相对值）
14.3
7.3
22.6
16.7
35.0
30.6
33.3
20.6
3.3
16.4
13.3
28.6
39.0
15.2
28.4
30.3
56.2
表4装液量对纤维素产量的影响
培养基装量/mL
50
100
150
纤维素干重/g
0．059
0．094
0．098
换算结果/g·100mL-1
0.118
0.094
0.065
表5培养方式对纤维素产量的影响
培养方式
Y0
Y1
Y2
Y3
注：Y表示摇床培养，Y后面紧跟的不带圈的数字表示摇床培养
的天数。Y0表示完全静置培养，Y6表示完全摇床培养，其他表示先
热风炉燃烧器
摇床培养一段时间后静置培养至发酵终止。
纤维干重（相对值）
74
43
19
8
培养方式
Y4
Y5
Y6
纤维干重（相对值）
8
9
9
尹娟等：细菌纤维素发酵技术初步研究437
湖北农业科学2009年杆菌产纤维素的条件为初始pH 值5．4，装量100
mL ·500mL －1三角瓶，接种量10％，28℃静置培养6d 。
经验证，细菌纤维素产量最高可达0．633g ·100mL －1。
参考文献：
［1］孙东平，张继东，周伶俐，等．木醋杆菌1．1812发酵产细菌纤维素的研究［J ］．南京理工大学学报，2005，29（5）：601－604．［2］贾士儒，欧纮宇，傅
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［3］张继东．木醋杆菌产细菌纤维素的研究［D ］．南京：南京理工大学，2004．
［4］
KRYSTYNOWICZ A ，CZAJA W ，WIKTOROWSKA－JEZIER-SKA A ，et al．Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose ［J ］．Journal of Industrial Microbiology ＆Biotechnology ，2002，29：189－195．
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Microbiology ＆Biotechnology ，2005，21：1323－1327．［6］欧纮宇，贾士儒，马
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食品与发酵工业．2002，29（1）：18－22．
［7］秦微微，迟玉杰．木醋杆菌发酵培养基的优化及发酵方式的探讨［J ］．中国酿造，2006（6）：33－36．［8］张
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1976．7－95．
［10］
马育华．田间试验和统计方法［M ］．北京：农业出版社，1982．
304－310．
（责任编辑郑威）
收稿日期：2008－11－12
基金项目：国家“十五”重大科技专项（2001BA501A20）；国家自然科学基金项目（20705009）；武
汉市晨光计划项目（200750731280）作者简介：李胜清（1977－），男，安徽旌德人，副教授，博士，（电话）************（）sqingli＠mail．hzau．edu．cn ；
通讯作者，刘汉兰，教授，（）hanlan＠mail．hzau．edu．cn 。
B 酸离子液体催化剂在生物柴油制备中的应用
李胜清a ，刘俊超a ，刘汉兰a ，孙
华a ，陈
浩a ，吴谋成b
（华中农业大学，a．理学院；b．食品科技学院，武汉
430070）
摘要：针对酸值较高的原料油在转化成生物柴油的过程中易使催化剂失活等问题，制备了Br觟nsted 酸性离子液体1－己基－3－甲基咪唑硫酸氢盐（［C 6MIm ］HSO 4），用于催化菜子油酯交换制备生物柴油。结果表明，在醇油摩尔比n （醇）∶n （油）＝15∶1、催化剂用量为原料油质量的8％、反应温度为90℃、反应时间为18
h 的条件下，生物柴油产率可达94％以上。B 酸离子液体催化剂与产品易于分离，重复使用5次以后，仍
然保持良好的催化活性。
关键词：B 酸离子液体；酯交换反应；菜子油；生物柴油中图分类号：TQ517．2
文献标识码：A
文章编号：0439－8114（2009）02－0438-04
Br觟nsted Acidic Ionic Liquid ［C 6MIm ］HSO 4Catalyst for Biodiesel Production
LI Sheng－qing a ，LIU Jun－chao a ，LIU Han－lan a ，SUN Hua a ，CHEN Hao a ，Wu Mou－cheng b
（a．College of Science ，b．College of Food Science and Technology ，Huazhong Agricultural University ，Wuhan ，430070）
Abstract ：In this paper ，Br觟nsted acidic ionic liquids of 1－hexyl－3－methylimidazolium hydroge
n sulfates （［C 6MIm ］HSO 4）was synthesized and explored as catalyst for transesterification of rapeseed oil with methanol to fatty acid methyl esters．The in-fluences of molar ratio of alcohol to triglyceride ，catalyst dosage ，reaction time and temperature on the transesterification were investigated．The molar ratio of alcohol to triglyceride was the most remarkable feature than catalyst dosage ，reaction temperature ，and time．In the optimum condition ，molar ratio of methanol to rapeseed oil of 15∶1（n ∶n ），adding 8％（W ／W ）of ionic liquid ，and interaction at 90℃for 18h ，the yield of product was more than 94％．The catalyst of ［C 6MIm ］HSO 4
was found still effective and stable even after five cycles of reaction with yields above 88％．The proposed ionic liquid cata-
lyst shows potential application in the production of biodiesel．
Key words ：Br觟nsted acidic ionic liquids ；transesterification ；rapeseed oil ；b iodiesel
第48卷第2期
2009年2月
湖北农业科学
H ubei
A gricultural S ciences Vol．48No.2
Feb ．，2009
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