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中国病原生物学杂志2020年12月第15卷第12期
Journal of Pathogen Biology Dec. 2020. VoL15・No. 12
DOI ：10. 13350/j. cjpb. 201210
•论著•
的生物信息学分析*
陈越.王国富」，吴利先
（大理大学基础医学院医学微生物与免疫学教研室，云南大理671000）
目的 运用生物学信息方法分析鸟分枝杆菌相关致病基因MAV2054编码蛋白的生物学特征。 方法 从
NCBI 中检索鸟分枝杆菌MAV2054蛋白基因信息。使用序列的fasta 格式用在线软件预测MAV2054蛋白理化性质、
跨膜区、信号肽、二级和三级结构、T 细胞和B 细胞表位、亚细胞定位，使用MEGA 软件构建系统发育树。 结果 MAV2054蛋白基因全长924个碱基，共307个氨基酸，其中亮氨酸（I.eu ）含量高达11.4%，丙氨酸（Ala ） 9. 1%、苏氨酸 （Thr ）9. 1%、无毗咯赖氨酸（PyD 和硒半胱氨酸（Sec ）.该蛋白拥有两个跨膜区（由内向外和由外向内），可能无信号肽。
MAV2054蛋白含有3个T 细胞表位和28个B 细胞表位。二级结构中a 螺旋占45%,0折叠15%。三级结构构建成
功，可信度96.7%。系统进化树结果显示MAV2054蛋白与M A V2941编码蛋白归一簇，相似度43%。 结论 生物信
息学分析MAV2054蛋白性质较稳定，含有多个T 细胞利B 细胞优势抗原表位，可作为鸟分枝杆菌肽疫苗研发新靶标。 关键词鸟分枝杆菌；MAV2054蛋白；生物信息学
中图分类号】R378. 911
【文献标识码】1673-5234(2020)12-1417-05
\_Journal of Pathogen Biology. 2020 Dec ； 15( 12) : 1417 —1421.]
Bioinformatic analysis of the protein encoded by the pathogenic gene MAV 2054 related to Mycobacterium avium
CHEN Yue, WANG Guo-fu, WU I ^i~xian (Department of Microbiology and I m m ujiology <, Dali University ,
Dali , Yunnan 671000, China )
Objectives To bioinformatically analyze the biological characteristics of the MAV2054 coding protein of
Mycobacterium avium . Methods Genetic information on the M. avium MAV2054 protein was retrieved from the NC
BI. The FASTA format of the sequence was used to predict the protein 1 s physical and chemical properties, transmem
brane regions, signal peptides, its sec o n d ary and tertiary structures , T-cell and B-cell epitop
es , and subcellular location of the MAV2054 prot&n using online software. The software MEGA was used to construct a phylogenetic tree. Results The MAV2054 protein gene is 924 bp in length and it contains a total of 307 amino acids, including leucine (Leu) content as high as 11. 4%, alanine (Ala) content of 9. 1 % , threonine (Thr) content of 9. 1%, and no pyrrole-lysine (Pyl) or sel
enocysteine (Sec). The protein has two transmembrane regions (from the inside to the outside and from the outside to the inside) and may not have a signal peptide. The MAV2054 protein contains 3 T-cell epitopes and 28 B-cell epitopes, a heli
ces account for 45% of the secondary structure and 0 sheets account for 15%. The tertiary structure was successfully de
termined with a reliability of 96. 7 %. The phylogenetic tree indicated that the MAV2054 protein is divided into two clus ters with four other proteins. Conclusion Bioinformatic analysis indicated that the MAV2054 protein is relatively sta
ble, it contains multiple T-cell and B-cell dominant epitopes , and it can be used as a new target for the development of M. avium vaccines.
Mycobacterium avium ； MAV2054 protein ； bioinformatics
鸟分枝杆菌属非结核分枝杆菌（NTM ）中的胞内寄
生菌，广泛存在于空气、水、土壤中。鸟分枝杆菌感染 引起的全身中毒症状和局部损害表现与结核病相似， 主要侵犯肺脏，合并人类免疫缺陷病（HIV ）感染易出 现肺外病变和播散性疾病，若不进行具体的菌型分析， 可长期误诊为但是，与不同的是鸟 分枝杆菌感染不会在人与人之间传播。鸟分枝杆菌常 感染免疫功能低下的人，如HIV 感染者。此外，鸟
分枝杆菌肺病在免疫功能正常人中的患病率呈逐年
葛根素片
上升的趋势工。MAV2054蛋白为鸟分枝杆菌重要的
致病蛋白，该蛋白在患者的机体中有免疫反应性，
MAV2054蛋白可通过巨噬细胞中的线粒体途径诱导 细胞凋亡。在氨基酸水平‘MAV2054蛋白与鸟分枝
国家自然科学基金项目（N 。. 81760357）.
王国富，E —mail ： guofuw@ 163. com
陈 越（ 1992-），女•山东人，在读硕士研究生。
主要研究方向：非结核分枝杆菌。E-mail ： *****************
中国病原生物学杂志2020年12月第15卷第12期
J ournal o f Pathogen Biology Dec.2020,Vol.15»No.12•1418•
杆菌亚种35ku主膜蛋白1具有100%同源性。MAV2054蛋白在鸟分枝杆菌肺病患者体中的抗体应答率显著高于患者和健康对照者'。
反向疫苗学是在全基因组水平上筛选具有保护性免疫应答的候选抗原为疫苗的开发策略。以微生物基因组为平台，高效克隆表达毒力因子、外膜抗原、侵袭力及毒力相关抗原，并纯化重组蛋白。再对纯化后的抗原进行机体内外评估.筛选保护性抗原，进行疫苗研究。反向疫苗学的优势在于适用任何有基因组测序的病原体'。T、B细胞表位具有使人体对抗病原体的潜能，有高抗原表位预测值的表位通常抗原性较强.其对于肽疫苗的制备具有重要意义。本研究拟分析MAV2054蛋白的高抗原性、无致敏性和毒性的T细胞、B细胞表位与载体结合.以研发鸟分枝杆菌的多表位或单表位肽疫苗.用于易感人免疫接种以减少鸟分枝杆菌感染。HIV感染患者中.Tim3/Gal-9信号可减少CD4T细胞表面CX-CR4和CCR5
的表达，增加p21的表达，从而使CD4*T细胞对于HIV的易感性降低.进而减少H1V的感染"。而在鸟分枝杆菌肺病个体中表达PI>1、CTLA-4和Tim-3的T细胞表达增加.表明抑制的T细胞介导的反应与鸟分枝杆菌感染的易感性有关仁在两类感染者中均有Tim-3的升高，而HIV感染者更易合并感染鸟分枝杆菌，因此亟待研发两类感染者的肽疫苗。
材料与方法
1鸟分枝杆菌MAV2054蛋白基本信息与理化性质分析
登录NCBI(https：//bi.v/)的GenBank中获取鸟分枝杆菌MAV2054蛋白的氨基酸序列•从NCBI的BLAST中检索蛋白基因序列。运用在线软件ExPASy(https：/// protparam/)分析目的蛋白的理论分子质量、等电点、吸光度等。
2跨膜区预测
运用TMpred在线软件(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form,html)预测MAV2054蛋白跨膜区。
3信号肽预测
使用SignalP-5・0(http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)在线软件预测MAV2054蛋白是否有信号肽。
4二级、三级结构预测
采用在线软件phyr(http：//www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2/html/page,cgi?D=index)预测MAV2054蛋白二级结构中的cr螺旋、折叠、p-转角和无规卷曲，并预测其三级结构.选取可信度最高的三维结构图。
5T、B细胞抗原表位预测
分别采用CTLPred(http//s.in raghava/ctlpred/index.html)及ABCpred(http：// crdd,osdd/raghava/abcpred/)在线软件分析T、B 细胞抗原表位。
6亚细胞定位
采用CELLO软件(http:/u.edu. tw/)预测目的蛋白存在于菌体的位置。
7系统发育树构建
使用MEGA-X软件.将鸟分枝杆菌MAV2O54蛋白与MAV2052、MAV2921、MAV2941、MAV5183编码蛋白的氨基酸fasta进行序列比对，构建分子进化树。
结果
1鸟分枝杆菌MAV2054蛋白基本基因信息与理化性质
鸟分枝杆菌MAV2054基因编码蛋白的氨基酸数共为307个.MAV2054基因全长924个碱基。该蛋白相对分子质量为33.67127X10.等电点4.96，分子式，总原子数4784。带正电残基总数(Arg十Lys)24个，带负电残基总数(Asp+ Glu)35个。在水中280nm处消光系数36900/ ()，吸光度(蛋白浓度为lg/L)1.096。在序列的N-末端是M(Met)的前提下，在哺乳动物网状细胞内的半衰期为30h.不稳定系数33.17，为稳定蛋白。Leu、Ala、Thr含量较高，分别占总量的11.4%、9.1%、9.1%。脂肪族指数101.01，蛋白亲疏水性平均值为一0.078，为非可溶性蛋白的可能性较大。
2蛋白跨膜区
MAV2054蛋白有2个跨膜区，分别在201—220和270-287位氨基酸，总评分为1376。N端存在于胞内段，从第201-220位氨基酸有一段由胞内向胞外的跨膜段；从第270-287位氨基酸有一段由胞外向胞内的跨膜段。因此鸟分枝杆菌MAV2054蛋白具有跨膜结构.能跨越脂质双层•为跨膜蛋白(表l)o
表1鸟分枝杆菌MAV2054蛋白跨膜螺旋特征
Table1The helices of MAV2O5J protein
方向起始位点终止位点评分优先推荐Orientation Start position End position Score Strongly prefered
由内向外
201220615是
Inside to outside helices
由外向内
270287761是Outside to inside helices
3信号肽
中国病原生物学杂志2020年12月第15卷第12期
Journal of Pathogen Biology Dec.2020,Vol.15,No.12•1419•
SingalP分析鸟分枝杆菌MAV2054蛋白SP（信号肽,Signal peptide）值为0.023 3.TAT（TAT信号肽,TAT signal peptide）值为0.0045,LIPO（月旨蛋白信号肽,Lipoprotein signal peptide）值为0.0017，峰值很低，提示MAV2054蛋白可能无信号肽。
4二、三级结构
二级结构预测显示鸟分枝杆菌MAV2054蛋白的二级结构中a螺旋占45%（绿）、（3折叠占15%（蓝）（图1）。过膜的a螺旋由于要适应疏水环境，因而绝大多数侧链是疏水性的，氨基酸序列中疏水性的长区域一般预示着一段过膜螺旋的存在。phyre2软件分析蛋白的三级结构见图2，三维结构预测可信度96. 7%，整体结构较疏松。
Confidence Kev昭姑曲23%)
H i9h(9)||||!|||lo W(o)
图1鸟分枝杆菌MAV2054蛋白二级结构预测Fig.1Secondary structure prediction of MAV2054protein
图2鸟分枝杆菌MAV2054蛋白三级结构预测
Fig.2Tertiary structure prediction of MAV2054protein
5T细胞抗原表位
细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）高效、特异性地杀伤胞内病原体感染细胞、肿瘤细胞
等靶细胞，而不损伤正常细胞。使用CTLPred在线系统以0.51为临界值，预测MAV2054蛋白的CTL表位有3个，每个均由9个氨基酸组成，评分由高到低排列（表2）。
表2鸟分枝杆菌MAV2054蛋白细胞毒性T细胞表位预测
Table2T cell epitope of MAV2054protein
多肽排序起始位点序列评分
Peptide Rank Start position Sequence Score 115AARQLANAT 1.000
287PREYTLRSI 1.000
3238TGEERQGVV0.990
6B细胞抗原表位
使用ABCpred在线软件分析MAV2054蛋白B 细胞抗原表位的筛选阈值为默认值0.51.选出评分大于阈值的表位共28个，按评分高低依次排列（表3）。评分越高成为B细胞抗原表位的可能性越大。
7亚细胞定位
CELLO在线软件分析鸟分枝杆菌MAV2054蛋白亚细胞定位见图3，其可能存在于细胞质或细胞膜.存在于细胞外基质中和细胞壁上的几率较低。
8系统发育树
将鸟分枝杆菌MAV2054蛋白（ABK67330.1 major membrane protein1Mycobacterium avium 104）和MAV2052编码蛋白（ABK6778&1
cysteine
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Journal of Pathogen Biology Dec.2020.Vol.15,Nc.12・1420・
synthase A Mycobacterium avium104)MAV2921编
码蛋白(ABK65473.1conserved hypothetical protein
Mycobacterium avium104)MAV2941编码蛋白
(ABK67484.1hypothetical protein MAV_2941My
cobacterium avium104)、MAV5183编码蛋白
(ABK67972.1antigen85-C Mycobacterium
auium104)一同构建系统发育树，结果如图4。
表3鸟分枝杆菌MAX2054蛋白B细胞抗原表位预测
Table3B cell epitope of MA\2054protein
排序表位序列起始位点评分
Rank Sequence Start position Score
1WVPVEAGIYRVNRVVN430.89
2AGA(；SEEPLPQTYVI)Y680.88
3LAGAPTPDDLDALITK1560.86
3IETIKERQELELINSP1240.86
4VDYETSPREYTLRSIS810.83
4TVPQLSTITPRWLLHL250.83
5QALGDLAARQLANATK90.82
5I.FGA QFITWROIPI」P2050.82
6EQAP(；LSVRFTGINQS2560.81
7LRSISTLVDIHTRVSD920.80
7YRGVPPPVVSLFCIAQF1950.80
8TWR(}IPLIPSI)KVPVE2120.79
9RVSDLYSSPHDQIAQQ1040.78
10TSLAVLTDDAL AVI」)D2820.76
10VRT(；EERQGVV(；LFQP2360.76
11GLLAQATPEQTIQTL A1420.73
12ELELINSPEY(；LLAQA1320.72
13ATYLVTLYTSLAVLTD2740.71
13RQLANATKTVPQLSTI170.71
14QVAIKAEA(；A(；SEEPL610.67
15VPVEDGKTKFILVRTG2240.66
16TSAQNESQAL(；I)L A AR20.62
17OINQSAIATYLVTLYT2670.60
18TKVWKTPSFFLTHP1X；1700.58
19TITPRWLLHLLNWVPV310.56
20PDDLDALITKVWKTPS1620.54
21TDI)A LAVLI)DVAV【)QF2880.53
21PHDQIAQQLRLTIETI1120.53
Analysis Report:CELLO RESULTS
SeqID:ABK67330.1major membrane protein1[Mycobacterium avium104)
SVM LOCALIZATION RELIABILITY Amino Acid Comp.Cytoplasmic0.487
N-peptide Comp.Cytoplasmic0.617
Partitioned seq.Comp.Cytoplasmic0.703
Physico-chemical Comp.Cytoplasmic0.791
Neighboring seq.Comp.Membra n e0.761
CELLO Prediction:
Cytoplasmic 2.766*
Membrane 1.973
固态高频Extracellular0.229
CellWall0.032
[h；七Documectot込
图3鸟分枝杆菌MAV2054亚细胞定位预测Fig.3Subcellular localization of MAV2054protein
图4鸟分枝杆菌MAV2054蛋白系统发育树
Fig.4Phylogenetic tree of MA\ 2054protein
讨论
巨噬细胞是对抗分枝杆菌感染的核心，它通过位于质膜、细胞内小泡或细胞质上的模式识别受体识别病原体相关分子模式'4。分枝杆菌通过外源性和内源件途径或caspase非依赖性途径诱导细胞凋亡。鸟分枝杆菌诱导的细胞凋亡是由TNF和Fas介导的，为外源性途径工。
生物信息学分析鸟分枝杆菌MAV2054蛋［'］不稳定系数33.17，性质较稳定.可能为非可溶性蛋白。蛋白的氨基酸组成以Leu,Ala,Thr占比较高，分别占总量的11.4%、9.1%、9.1%.无Pyl和Sec。亮氨酸是带脂肪侧链的氨基酸.町与绷氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸堆积在一起形成蛋门质的疏水中心。苏氨酸在甲基的存在下疏水性更强，因而苏氨酸更倾向于出现在0折叠中。鸟分枝杆菌MAV2054蛋白是跨膜蛋白，具有201-220和270-287两个跨膜区。可能无信号肽。其二级结构中a螺旋高达45%.p折叠占15%，这与MAV2O54蛋白是跨膜蛋白的预测相一致。3个优势CTL细胞表位AARQLANAT.PREYTI.RSI、TGEERQGV V，其中PREYTI.RSI和TGEERQGVV 邻近B细胞表位。预
测该蛋白含有28个B细胞表位，其中只有评分高的部分表位能成为真正的B细胞表位。T细胞的1个表位起始点位于该蛋白两跨膜区之间，B细胞表位中仃4个表位的起始位点在跨膜区中，5个表位的起始位点在两跨膜区间。通过亚细胞定位.目的蛋白为细胞质蛋白和细胞膜的可能性较大•但尚不能排除存在于细胞外基质和细胞壁中的町能。
进化树构建结果表明，5种蛋白被分成2簇
，
中国病原生物学杂志2020年12月第15卷第12期
播放路Journal of Pathogen Biology Dec.2020.Vol.15.No.12
MAV2054编码蛋白、MAV2921蛋白、MAV2O52蛋白呈现一簇，鸟分枝杆菌MAV2941编码蛋白和MAV5183编码蛋白为一簇。鸟分枝杆菌MAV2054蛋白和MAV2052编码蛋白有相似的作用机制使宿主细胞凋亡。其均以活性氧累积触发Casp-8激活引起Bax易位至线粒体,Casp-9激活后Casp-3随之激活，巨噬细胞凋亡。同时会出现巨噬细胞释放TNF-a JL-6。不同的是鸟分枝杆菌MAV2054蛋白促凋亡途径还有活性氧依赖性JNK激活诱导线粒体功能障碍，目的蛋白通过这两条途径诱导巨噬细胞凋亡"J鸟分枝杆菌MAV2054蛋白和MAV2941编码蛋白有43%的同源性，但它们促凋亡的作用却不经相同。MAV2941编码蛋白是鸟分枝杆菌的分泌蛋白之一，其与转运相关蛋白AP3B1、syntaxin-8和archinl蛋白竞争结合PI3K位点，通过肌动蛋白进入巨噬细胞，触发细胞骨架重排与甘油醛3-磷酸脱氢酶磷酸化。鸟分枝杆菌进入巨噬细胞内在一个不会被酸化的液泡中，阻止了该菌与H+泵的结合，干扰巨噬细胞转运蛋白山。结合进化树分析可见相似度较高的蛋白其作用机制可能相似或相同，同源性低的蛋白之间可能出现不同的作用机制，出现这种现象的原因尚不清楚。由鸟分枝杆菌引起的巨噬细胞凋亡很可能是在众多蛋白的相互共同协助下通过不同或相似的多条途径完成。
鸟分枝杆菌在HIV阳性和HIV阴性人中占主导地位X。鸟分枝杆菌为常见的非结核分枝杆菌感染菌种，是自然选择的结果。本次研究采用生物信息学软件工具对鸟分枝杆菌MAV2054蛋白进行预测，可为鸟分枝杆菌肽疫苗研究提供新的靶标。
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