王红梅;戴纪刚
【摘 要】背景与目的 已有的研究表明:线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变和拷贝数的改变和肿瘤有着密切联系;大多数实体性肿瘤中mtDNA拷贝数有明显降低.本研究旨在探讨线粒体基因组含量的改变和原发性非小细胞肺癌(non-small cell lung cance,NSCLC)的关系.方法 通过实时荧光定量PCR,对肺癌及相对应的癌旁肺组织mtDNA的含量进行精确定量(拷贝数/细胞).结果 肺癌组织mtDNA的平均拷贝数/细胞为395±125,而相对应的正常肺组织为733±196,前者明显低于后者(P<0.001).肺癌mtDNA含量的改变与患者性别、年龄、是否吸烟及肿瘤的病理类型无关(P>0.05).结论 mtDNA含量的改变与NSCLC的发生发展密切相关,同时也可能影响其和预后.%Background and objective It has been proven that the mitochondrial DNA (mtDNA) mutations and content change were associated with increasing risk of tumorigenesis.MtDNA content is significantly reduced in most substantive tumors.The aim of this study is to demonstrate whether mtDNA content is positively associated with non-small cell lung cancer (NSCLC) risk.Methods MtDNA content in 37 mat ched lung carcinoma and histologically adjacent normal lung tissue samples from patients were analyzed by fluorogenic 5-nuclease real-time PCR techniques.Results The mean copy number of mtDNA in lung carcinoma tissue samples was statistically lower than that in adjacent histologically normal lung tissue samples (P＜0.001).Conclusion The change of mtDNA content may play an important role in NSCLC.
【期刊名称】《中国肺癌杂志》
【年(卷),期】2011(014)002
【总页数】5页(P141-145)
【关键词】线粒体DNA;肺肿瘤;突变
【作 者】王红梅;戴纪刚
【作者单位】400037,重庆,第三军医大学新桥医院胸外科;400037,重庆,第三军医大学新桥医院胸外科
【正文语种】中 文环保柴火灶
【中图分类】R734.2
线粒体是真核细胞的重要细胞器，作为细胞的“动力工厂”，它在细胞的能量代谢和氧自由基生成过程中扮演重要角。同时，线粒体也是细胞凋亡调控的关键元件，这些细胞器收集并处理有关细胞代谢和信号转导级联各方面的信号，决定着细胞的命运，参与了细胞死亡的执行过程。能量代谢模式的转换是癌细胞的重要特征。细胞在癌变过程中，将线粒体关闭，能量来源转换为糖原酵解模式，同时线粒体启动异常细胞凋亡的作用消失，这些细胞就可能“永生化”及癌变。线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）含量（即拷贝数）及氧化磷酸化相关酶活性的降低是肿瘤能量代谢发生改变的主要原因。为了解非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）组织中mtDNA的拷贝数是否发生改变并探讨mtDNA拷贝数改变与NSCLC的相关性，本研究通过两个单独的实时荧光定量PCR对肺癌及相对应的癌旁组织mtDNA的含量进行了精确定量（拷贝数/细胞）。
1 材料与方法
动静压主轴
1.1 病例资料 所用37例肺癌组织和37例癌旁肺组织均取自第三军医大学附属新桥医院2006年-2008年外科手术患者，均经病理确诊。癌旁肺组织标本为同一患者病灶远端5 cm以上的正常肺组织，均经组织学诊断，证实其没有癌细胞。本组患者男性28例，女性9例，吸烟及曾经吸烟者24例（吸烟者：每天吸烟10支以上且吸烟时间超过1年。本组中包括曾经吸烟而现戒烟1年以上者9例），不吸烟者13例。患者年龄30岁-75岁，中位年龄为55岁。组织学病理分型情况为：鳞癌23例，腺癌14例。
1.2 组织全基因组DNA提取 采用酚、氯仿、异戊醇抽提法提取全基因组DNA（包括mtDNA）。所得DNA溶于TE buffer（10 mM Tris±HCl, 1 mM EDTA, pH8.0），并用紫外分光光度计测定其波长260 nm时的吸光度（ OD260 nm）值，计算DNA 浓度，-20 oC保存备用。
1.3 PCR引物及TaqMan探针 所有引物由上海基康生物技术有限公司合成、标记。本实验中应用的荧光检测物质有FAM（6-Carboxy-fluorescein）和TAMRA（6-Carboxytetramethy-rhodamine），其中FAM作为报告基因（Reporter），标记在TaqMan探针的5'。TAMRA作为熄灭基因（Q uencdher），标记在TaqMan探针的3'。TaqMan探针
与目的基因的结合部位在两个引物之间。用于扩增人mtDNA D-loop HV1（Hipervariable region 1, HV1）和核β-globin基因的引物及TaqMan探针见表1。
1.4 线粒体HV1和核β-globin基因实时荧光定量PCR检测
1.4.1.1 HV1和β-globin基因片段的PCR扩增 PCR反应体系为25 μL，终浓度为：Taq酶2 U，MgCl2 2.5 mmol/L，dNTP各200 μmol/L，引物各0.5 μmol/L，模板DNA约100 ng 。反应条件：94 oC预变性5 min，其余40个循环94 oC、30 s，55 oC、30 s，72 oC、1 min，最后72 oC延伸10 min。
1.4.1.2 PCR扩增产物的克隆 用TaKaRa公司的试剂盒对PCR样品进行纯化后，分别将128 bp HV1和110 bp β-globin扩增产物克隆至PMD18-T载体（TaKaRa公司），筛选含有插入片段的载体，以JM109感受态细胞进行转化。用质粒提取试剂盒（QIAGEN公司）提取质粒。车载数字电视
1.4.1.3 质粒的鉴定与测序 将部分所提取的质粒经过PCR和序列测定进行鉴定，测序反应
由上海基康生物技术有限公司完成 。
1.4.1.4 质粒浓度测定及拷贝数换算 紫外分光光度计检测其OD260值。质粒浓度（ng/μL）=OD260×50 μg/mL×稀释终体积（mL）×1,000/稀释时加入的原始溶液体积（μL）。质粒拷贝数（Copies/μL）=质粒浓度（ng/μL）×6.02×1014/660×碱基数（载体+插入片段）。
1.4.1.5 标准品的梯度稀释 以无菌去离子水10倍比梯度稀释HV1和β-globin质粒分别获得浓度为1×103-1×107拷贝/μL的制备定量PCR标准曲线的模板。
1.4.2 实时荧光定量PCR检测
1.4.2.1 PCR反应 25 μL体系中含ABI TaqMan 1×PCR Master mix、3.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP、引物各0.5 μmol/L、荧光探针50 nmol/L、模板各2.0 μL 。每次检测设置3个NTC（no template control）。每个样品进行3个平行样实验。
胎盘提取液
1.4.2.2 PCR反应条件 50 oC、2 min，95 oC、10 min；然后95 oC、15 s，60 oC、30 s，共50个循环。TaqMan PCR Core试剂盒、光学PCR管、7700型PCR仪均为PE公司产品。
压铸机料筒的设计
1.4.2.3 HV1和β-globin标准曲线绘制 将不同梯度浓度的标准品，与待测样品同时进行定量PCR扩增，绘制标准曲线。
1.4.2.4 mtDNA拷贝数的检测 通过两个单独的实时荧光定量PCR分别对待测样本中线粒体HV1和核β-globin基因进行定量。以mtDNA HV1和核单拷贝基因β-globin分别作为线粒体和核DNA拷贝数的标记。mtDNA的含量，即相对拷贝数/二倍体核基因组（diploid nuclear genome）=2×HV1/β-globin[1]。
1.5 统计学方法 计量资料以Mean±SD表示，使用SPSS 11.0统计学分析软件进行t检验和线性回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 克隆质粒的鉴定 提取经筛选的用于制作标准曲线模板的质粒，经过PCR及序列测定证实，HV1和β-globin基因PCR片段已分别连接至PMD18-T载体上，并用所建立的实时荧光定量PCR检测，可见有明显的荧光信号。
座便轮椅2.2 标准曲线的制备 根据不同浓度的标准品测得的荧光信号到达设定的域值时所经历的循
环数（threshold cycle,Ct）值绘制标准曲线（图1）。不同浓度标准定量的模板与Ct值呈直线相关。HV1和β-globin基因定量PCR标准曲线的相关系数分别为0.998和0.999，斜率分别为-3.159和-3.400。
2.3 肺癌mtDNA拷贝数的改变 为了解肺癌组织中mtDNA含量的改变，我们通过两个单独的实时荧光定量PCR，对肺癌及相对应的癌旁肺组织mtDNA含量进行了精确定量（拷贝数/细胞）。线性回归分析表明，肺组织mtDNA拷贝数和相对应的正常肺组织mtDNA拷贝数之间有相关性（r=0.589, P＜0.01）（图2）。肺癌组织mtDNA的平均拷贝数/细胞为395±125，而相对应的正常肺组织为733±196，前者明显低于后者（P＜0.001）。
2.4 肺癌mtDNA拷贝数改变和临床指标的相关性 根据患者性别、年龄、是否吸烟、病理类型，我们将37例样本进行分组。统计结果显示，肺癌mtDNA拷贝数的改变与患者性别、年龄、是否吸烟及肿瘤的病理类型无关（P＞0.05）（表 2）。
)t (bp uc prod CR 0 8 of P 1112 th ng Le AT CA CTG CT GC CC AG GA GT)TT TA'-3'TG TC TA AC CA TT GTAC ATAC GA(5AG TC CG AA GT ce GA GT CA GC AA ATAA GT AT uct en GA AG GT CT TC CA CC TA TG prod qu Se TG TT TTAC GT CC AA AC AC GC G
G AC CA CR CT AC CA AT TG of P CC GC CC TT GT GA th CT ng le nd nce a e am rr rr ue e n prob e rime rime e rime rime针prob e seq nd er a Prob ard p rw rse p ve Prob ard p rw rse p ve探an Prim Fo Re Fo Re an qM qM Ta Ta和列er a nd序in 1 引物Prim et表Ta b 1rg Ta β-glob 1 HV
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议