特产研究25
Special Wild Economic Animal and Plant Research
DOI：10.j.2021.046
‘申
陈芳1，覃健峰1，郑德滨1，袁红艳2，吴琼1※
（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012；2.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海201400）
摘要：为了从分子角度解析‘申鸿七彩雉鸡’种遗传背景，本研究采用PCR测序方法，对3个个体‘申鸿七彩雉鸡’的线粒体全基因组进行测序，并与NCBI公布的7条雉鸡线粒体基因组序列比对，构建系统进化树。获得‘申鸿七彩雉鸡’线粒体全基因组序列全长为16685bp，结构为典型的环状双链，包括13个蛋白质编码基因、2个rRNA、22个tRNA和D-Loop区。蛋白编码基因总长度为11369bp，基因重叠有7处，间隔有20处；D-loop序列长为1148bp，占整个基因的6.88%；tRNA基因长度为65~78nt。‘申鸿七彩雉鸡’线粒体全基因组、蛋白质编码基因、tRNA、rRNA和D-Loop区碱基组成中AT含量均大于CG含量。构建的进化树发现， ‘申鸿七彩雉鸡’和‘甘肃亚种雉鸡’聚为一类。
关键词：
‘申鸿七彩雉鸡’；线粒体全基因组；系统发育关系
中图分类号：S865.3文献标识码：A文章编号：1001-4721（2022）
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02-0025-06
CHEN Fang1,QIN Jian-feng1,ZHENG De-bin1,YUAN Hong-yan2,WU Qiong1※
(1.College of Life Science,Longyan University,Longyan364012,China;2.Shanghai Xinhao Zhen Poultry Breeding Co.，
Ltd.，Shanghai201400,China
)
:The aim of this study was to reveal the genetic relationship of'Shenhong pheasant'in China.The mitochondrial genome of three pheasant varieties were sequenced and analyzed to study the genetic diversity by PCR method.The results showed that the entire mtDNA sequence was16685bp in length and contained13protein-coding genes,2rRNA genes,22tRNA genes,and a control region(D-loop),Its gene arrangement pattern was identical with those of other avians.The total length of protein coding gene is11369bp,with7overlapping genes and20intervals.The length of D-loop sequence is1148bp,accounting for6.88%of the whole gene.The length of tRNA gene is 65-78nt.The AT content in the whole mitochondrial genome,protein coding genes,tRNA,rRNA and D-Loop regions
of'Shenhong pheas-ant'are higher than CG content.'Phasianus colchicus strauchi'and'Shenhong pheasant'were closer by evolutionary
tree.
:
'Shenhong pheasant';mitochondrial DNA;phylogenetic relationship
雉鸡，学名环颈雉，俗称野鸡、山鸡。在动物分类学
属于鸟纲（Aves）鸡形目（Gallinales）雉科（Phasianidae）
雉属（Phasianus）。雉鸡在我国饲养较早，3000年前殷
商甲骨文中记载有“雉”字。《本草纲目》详细记载了雉
鸡各部位的药用价值[1,2]。在野生状态下，雉鸡分为30
个亚种，其中在我国境内分布有19个亚种，除西藏和
海南外，全国各地均有分布。我国对雉鸡大规模驯养和
研究始于20世纪60年代，1981年获得成功，自此雉
鸡人工养殖技术在全国范围内进行了大规模的推广普
及。我国雉鸡饲养业历经30多年的发展，从无到有，
从小到大，得到了飞速的发展[3]。
‘申鸿七彩雉鸡’（Shenhong pheasant）是2011年
由上海欣灏珍禽育种有限公司联合中国农业科学院特
产研究所等4家单位历经7年联合选育的肉蛋兼有
收稿日期：2021-03-19
基金项目：科技部国家科技基础条件平台“特种动物种质资源库”（TZDWZYK2019-07）；中央引导地方科技发展专项（2019L3011）作者简介：陈芳（2000-），女，本科，从事动物科学专业研究。
※通讯作者：吴琼（1978-），女，博士，副教授，硕士生导师，从事珍禽资源评价和遗传育种研究。
特产研究2022年第44卷第2期26
型雉鸡新品种，2019年通过国家畜禽遗传资源委员会审定。
‘申鸿七彩雉鸡’18周龄上市体重公雉达1350g、母雉鸡达1000g，饲养56周龄日产蛋130个。与其他雉
鸡品种相比，生长速度快、肉用性能好且产蛋多，中试结果体现了较强的适应性，具有先进的综合生产性能，符合市场需求，具有广阔的推广前景。
线粒体基因组结构简单，编码基因内不含内含子，能够独立地进行复制和转录，世代间无基因重组。线粒体严格遵循母系单性遗传的特性，单一的一个样本就能够携带体的全部基因，代表一个母系体特征，通过少量的样本就能够对体的遗传结构进行全面分析，而且结果可靠，有利于体遗传研究[4,5]。‘申鸿七彩雉鸡’的线粒体全基因组序列目前还未见报道，本研究利用PCR测序方法，获得‘申鸿七彩雉鸡’线粒体全基因组全长序列，并与其他雉鸡序列构建系统进化树，为‘申鸿七彩雉鸡’种质资源的保护和利用提供科学依据。
1材料与方法
1.1样本采集龙芯3b
样本来自上海欣灏珍禽育种有限公司3层笼养的‘申鸿七彩雉鸡’3个个体。翅静脉采血，EDTA抗凝，充分混匀保存于﹣20℃冰箱备用。
1.2血液DNA提取和鉴定
参照南京诺维赞生物科技股份有限公司的全血基因组DNA快速提取试剂盒（柱式），具体步骤见说明
书。利用琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察电泳结果，DNA条带为单一致密的样品可作为后续试验材料，说明DNA质量较好且无降解。利用分光光度法检测DNA浓度，样品的OD260nm/OD280nm比值在1.6~1.8之间，则表明DNA纯度较高。检测合格后放置﹣20℃冰箱备用。
1.3引物设计
根据线粒体DNA环状双链闭合的结构特点，参照NCBI中已公布的雉鸡线粒体基因组全序列（登录号：FJ752430），Primer Premier5.0和Oligo6.0设计覆盖雉鸡线粒体全序列的引物，见表1，由上海生物工程有限公司合成。新合成引物需低速离心后，按照引物合成单上的说明，用灭菌双蒸水稀释到20
m，室温溶解3h以上，然后﹣20℃保存。
表1扩增片段的PCR引物Table1Primers for PCR
名称Name
位置Location
产物长度（bp）
Size
序列
Sequence
退火温度（℃）
Annealing temperature 上游引物
Upstream primer
下游引物
Downstream primer
Z01380182814485'GGTTATGCTCGCCGTATCA3'
5'TAAGCGTTTGTGCTCGTAGTT3'
59
Z021212298017685'CCCGCCTTCTACCACTATAA3'
5'TGAGGGAGTCAAATAGGGTT3'
55
Z032920497520505'TGCGTCAAAGCTCCCTCA TT3'
5'AAGGCTAGGGTTAGGGGGAG3'
56
Z044825646616415'TCCTATTCCTGAACCCAAGC3'
5'CTTGTTTGGTTAGTTCTTGGAT3'
57
Z055465671412495'GAGCATAACCAACGCCTGAT3'
5'TTAGGTAAAGAGTGCCAATGTC3'
60
Z066399773813405'TGAATGCAAATCAGACGCT3'
5'ATGAGTTAGCAAGGACGA TTC3'
58
Z077106887417695'CTTAGCAGGTGTTTCCTCCAT3'
5'TAGTCGTCCAGGGA TTGCGT3'
53
Z0882691013918715'CTCCACTCATGAGCCGTACC3'
5'TGCTCTTCTCTGGGTTGATACC3'
56
Z0994311139019605'CCTAAACAAGGCAGGTCACA3'
5'GA TAGGTCCAAGGGCGAA T3'
61
Z10109921297719865'ATCAGCCCGACTCCCATTCT3'
5'CAGTTCTTGCTGGCTTGG3'
56
Z11126591378411265'GCCTCTTACACCCTCTACATAC3'
5'TCTATTGCTGCTGGAAGTCAT3'
58
Z12135501545819095'ATGATGACAAGGACGAGCTG3'
5'GAGGAAGTGTAAGGCGAAGA3'
57
Z1314839179217285'TCTTACCTGGGTTCTTTCGC3'
5'CACGCAAACCGTCTCATCG3'
55
第2期27
1.4PCR 扩增及测序
根据提取的DNA 模板长度进行PCR ，对反应体
系进行优化配置，并通过梯度PCR 摸索合适的退火温度及反应条件。
PCR 反应体系为25L ：
2Es Taq Ma-sterMix 15L 、上下游引物各0.5L ，DNA 模板 1.0L ，dd H 2O 11.5L 。PCR 反应条件为：预变性94℃，5min ，变性94℃，30s ，退火以实际摸索的温度，30s ，延伸72℃，60s ，再延伸72℃，5min ，循环数为35次。PCR 产物在1%琼脂糖凝胶（含核酸染料）上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照保存。选取符合条件的PCR 产物送往上海生物工程股份有限公司测序。1.5
数据分析
使用Geneious 软件进行雉鸡线粒体全基因组
序列注释分析
。
构建进化树，建进化树之前，使用Dambe 5进
行碱基替换饱和性分析，在核苷酸序列显示未饱和的前提下，方可建树[6]。使用jModelTest 2.1.7[7]计算似然值，基于BIC 标准对数据进行模型选择[8]，线粒体13个蛋白质编码基因的最优模型为HKY+I+G 。
使用Mega 7.0软件采用最大似然法（Maximum Likelihood method,ML ）构建系统进化树，自举检验参数设置为1000次。
2结果与分析
2.1
基因组DNA 提取、PCR 扩增及测序结果取DNA 样品 3.5L 经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。电泳条带在15000bp 以上，与目的片段一致，条带单一明亮，可用于后续试验
。
图1
基因组DNA 电泳图
Fig.1
Electrophoretic analysis of genomic DNA
2.2‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组的序列分析
组装注释得到‘申鸿七彩雉鸡’3个样品的全线粒体基因组，3个样品的线粒体基因组完全相同，全长为16685bp 。结构均为典型的环状双链，包括13个蛋白质编码基因
（
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
和
）、
2个rRNA （12S rRNA 和16S rRNA ）、22个tRNA 和一个非编码的控制区（D-Loop ）。
‘申鸿七彩雉鸡’
13个蛋白编码基因总长度平均为11369bp ，占整个基因组的68.13%，其
中由
L 链编码，其余均由H 链编码。‘申鸿七彩雉鸡’最长的蛋白质编码基因
是
，为1818bp ，最短的
是
基因，为165bp 。13个蛋白质编码基因中，密码子规律同中国环颈雉。基因重叠有7处，总长度为30bp ；基因间隔为20处，总长度为52bp ；基因间无间隔和重叠有11处。
表2‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组基因定位和特征表
Table 2
Gene locations of mitochondrial genome of 'Shenhong pheasant'
基因
Gene 类型Type 长度（bp ）
Length 重叠或间隔Spacer or overlap
起始密码子Start codon
终止密码子Stop codon
控制区D-Loop 11480--tRNA-Phe tRNA 670--12S rRNA rRNA 9660--tRNA-Val tRNA 750--16S rRNA rRNA 16190--tRNA-Leu （UUR ）
tRNA 73-1-
-gene
97512ATG TAA tRNA-Ile tRNA 720--tRNA-Gln tRNA 716--tRNA-Met
tRNA 69-1-
-gene
10390ATG T tRNA-Trp tRNA
78
--
陈芳，等：‘申鸿七彩雉鸡’
mtDNA 全基因组序列测序和系统发育关系分析
特产研究2022年第44卷第2期
28
续表2
基因Gene 类型
Type 长度（bp ）
Length 重叠或间隔Spacer or overlap
起始密码子Start codon
终止密码子Stop codon
tRNA-Ala tRNA 692--tRNA-Asn tRNA 733--tRNA-Cys tRNA 672--tRNA-Tyr tRNA 71-1-
-gene 15511GTG AGG tRNA-Ser （UCN ）tRNA 75-9--tRNA-Asp tRNA 692-
-gene 6841ATG TAA tRNA-Lys
斑图
tRNA 681-
-gene 1651ATG
TAA gene 684-10ATG
TAA gene
784-1ATG T tRNA-Gly tRNA 661-
-gene 3472ATG TAA tRNA-Arg
tRNA 691-
-gene 2970ATG
TAA gene
1378-7ATG T tRNA-His tRNA 690--tRNA-Ser （AGY ）tRNA 651--tRNA-Leu （CUN ）
tRNA 711-
-gene 18180ATG
TAA gene
11434ATG TAG tRNA-Thr tRNA 692--tRNA-Pro tRNA 692-
-gene 5226ATG TAG tRNA-Glu
tRNA
68
1
-
-
2.3rRNA 和D-loop 序列控制区
‘申鸿七彩雉鸡’
12S rRNA 和16S rRNA 长度分别为966bp 和1619bp ，占整个基因组的5.79%和9.70%。两个rRNA 位于tRNA-Phe 和tRNA-Leu （UUR ）之间，被tRNA-Val 基因分隔开。D-loop 序列控制区位于tRNA-Phe 和tRNA-Glu 之间，序列长为1148bp ，占整个基因组的6.88%。2.4
tRNA
tRNA 基因共有22个，长度为65~78nt ，
tRNA 全长为1541bp ，占整个基因组的9.24%。tRNA 基因中最长为tRNA-Trp ，最短为tRNA-Ser （AGY ）。tRNA 均可以折叠形成三叶草结构。
2.5‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组碱基组成特征
‘申鸿七彩雉鸡’线粒体全基因组、蛋白质编码基因、tRNA 、rRNA 和D-Loop 区碱基组成见表3。所有基因AT 含量均大于CG 含量，
D-Loop 区的AT 含量最高，为60.02%，其次是含量为58.73%的tRNA ，最低为PCG ，含量55.33%。
表3‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组碱基组成
Table 3
Base composition of mitochondrial genome of 'Shenhong pheasant'
碱基组成Base composition
A （%）T （%）C （%）G （%）A+T （%）C+G （%）Total 30.6425.2830.8113.2755.9244.08PCGs 29.9125.4233.0011.6755.3344.67tRNA 33.1025.6324.5816.7358.7341.31rRNA 33.8521.0427.0418.0754.8945.11D-Loop
27.44
32.58
25.78
14.20
60.02
39.98
第2期29
2.6‘申鸿七彩雉鸡’与其他雉鸡进化关系
选择NCBI （bi.v/）发布的7条雉鸡线粒体全基因组序列，包括日本绿雉2条、环颈雉4条和甘肃亚种雉鸡1条，与本研究的‘申鸿七
彩雉鸡’均提取13个蛋白质编码基因序列。构建的系统发育树显示，10个雉鸡种分为两支，‘申鸿七彩雉鸡’和‘甘肃亚种雉鸡’聚在一起。日本绿雉和环颈雉聚在一起（图2和图3）
。
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图2
基于蛋白质编码基因的‘申鸿七彩雉鸡’与雉鸡进化树（ML ）
Fig.2Electrophoretic analysis of genomic
DNA
图3基于蛋白质编码基因的‘申鸿七彩雉鸡’与雉鸡进化树（NJ ）Fig.3
Electrophoretic analysis of genomic DNA
陈芳，等：‘申鸿七彩雉鸡’
mtDNA 全基因组序列测序和系统发育关系分析
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