活肽粉
中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology2021，43( 1):73-82 DOI: 10.11844/cjcb.2021.01.0010 李智国张方方刘悦刘建兴金亮*
(中国药科大学，南京211100)小功率电磁炉
摘要 脂肪组织易获取、组织相容性好且对供体影响小，可作为获得成体干细胞的重要来源。基质血管组分(S V F)是从脂肪中分离出来的包括脂源性干细胞(A D S C)和基质细胞的异质性细 胞。S V F促进组织的修复和再生已被大量的临床实验所证实，尤其是在美容整形和组织修复中 的应用。早期，S V F通过酶消化法获得，随着近年来在临床中扩大应用，为确保患者安全和质量可控，开发出新型自动分离设备。同时，为符合一些国家监管要求，避免酶的使用，采用非酶消化法获取 S V F。因此，该文主要针对基于酶消化法和非酶消化法已经发表临床分离方法和上市的相关设备 作详细论述。 关键词基质血管组分；酶消化法；非酶消化法；分离设备；
干蒸房The Research of Clinical Separation of SVF (Stromal Vascular Fraction)
LI Zhiguo,Z H A N G Fangfang,L I U Y u e,L I U Jianxing,JIN Liang*
{China Pharmaceutical University, Nanjing 211100, China)
Abstract Adipose tissue is an important source of stem cells because i t is easy to access and has a g o o d histocompatibility and l i t t l e influence on donors.S V F(stromal vascular fraction)is a heterogeneous group of cells isolated from adipose tissue,including A D S C(adipose derived stem cell)and stromal cells.According to a large n u m b e r of clinical trials,S V F has been proved that i t can promote tissue to repair and regenerate,especially in cosmetic surgery and tissue repair.In the early stage,S V F w a s obtained by e n z y m e digestion.With the extensive application of S V F in clinical practice during recent years,in order to ensure patient safety and quality control,s o m e n e w automatic separation equipment w a s developed.M e a n w h i l e,in order to meet the regulatory requirements of s o m e countries and avoid the use of e n z y m e,non-enzymatic digestion m e t h o d b e c o m e s a w a y of obtaining S V F. Therefore,current essay i s primary to m a k e a detailed discuss about reported clinical separation w a y s a nd related equipments based on the e n z y m e digestion and non-enzyme digestion.
K e y w o r d s stromal vascular fraction;enzymatic digestion;non-enzymatic digestion;separation equipment
I960年，R O D B E L L l[11首次将大鼠脂肪通过胶 原酶消化，离心后脂肪分成三个不同密度层，最下 层为颗粒层，该层包含多种细胞体。2111(：等[21在 此方法的基础上进行改进，通过微孔过滤从抽脂吸 脂剂中分离出该细胞，并证明该细胞中含有与 骨髓间充质细胞具有相似表型和分化潜能的一种多能干细胞。2013年，国际脂肪疗法与科学联合会
收稿日期：2020-07-22 接受日期：2020-10-23
•通讯作者。Tel: 187****4536,E-mail:****************** Received: July 22, 2020 Accepted: October 23, 2020•Correspondingauthor.Tel:+86-187********,E-mail:****************** URL: /arts.asp?id=5429(International Federation for Adipose Therapeutics and Science,I F A T)和国际细胞学会(International S ociety for Cellular Therapy,I S C T)共同 发表声 明定义 该细胞为基质血管组分(stromal vascular fraction, S V F)，明确S V F是一种主要包括脂源性间充质干细 胞(adipogenic stem cell,A D S C)、内皮/内皮祖细胞、淋巴细胞、造血系细胞、周细胞等组分的异质性细 胞S V F具有极强的血管再生和组织修复特性，一方面归因于不同细胞具有不同的功能，如A D S C
作为一种成体干细胞具有多向分化潜能，淋巴细胞
74.综述.f型钢
诱导免疫耐受降低患者免疫反应，内皮/祖细胞是形 成血管的重要细胞。另一方面，S V F不同细胞分 泌大量的细胞因子间可相互协调作用，如A D S C产 生的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,V E G F)有助于内皮祖细胞迁移，内皮祖细胞 产生的血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor B B,P D G F-B B)促进A D S C的增殖与迁移141。S V F在关节性病变、雄激素性脱发、肛瘘、血管性 病变等多种疾病中均表现出良好的作用，使其 具备广泛的临床应用前景[54。
S V F的分离方法目前尚未统一，基于酶的角度 可被分为酶消化法和非酶消化法。酶消化法采用 I型或II型胶原酶破坏脂肪细胞外基质(extracellular matrix,E C M)，非酶消化法采用乳化、离心、振荡、涡旋等机械或物理方法破坏E C M，释放血管周围的 细胞组分。酶消化法分离S V F技术成熟、细胞产量 高，缺点是成本较高、时间长、受监管和易受污染。非酶消化法分离S V F低成本、少接触和更省时，缺点 是细胞产量不高、易产生过多细胞碎屑等。针对各 自的优缺点，在酶法和非酶法的基础上，为实现更快 速、更封闭及高细胞产量等，相继开发了一系列半 自动/全自动分离提取设备，现就S V F在酶消化法和 非酶消化法基础上新开发的一些分离方法和设备进 行综述，为实验室研究和临床使用选择提供指导建 议。
1酶消化法
1.1胶原酶
S V F分离使用的胶原酶主要是从梭状芽孢杆菌 中分离纯化所得的一种中性蛋白酶，可以有效降解 E C M，释放结缔组织中的细胞。实验研宄和临床使 用的酶大部分为I型和II型胶原酶，如德国S E R V A生 产的N B4和N B6临床级酶，它是I型和II型胶原酶、酪 蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶的混合酶。通常混 合型的酶相比单一的胶原酶能分离得到更多的单核 细胞，但由于更多外源物的引入，分离得到的细胞需 进行更充分地洗涤以减少酶的残留量。
1.2经典胶原酶法
酶消化法是获取S V F最常用也是S V F产率最 高的方法。在抽脂手术中，为获取S V F，通常将胶原 酶溶液与混合吸脂剂预先混合，胶原酶和脂肪组织 混合物经37 °C振动消化、离心、洗涤和过滤之后即可得到S V F，分离流程见图1。利用此方法获取的 S V F细胞量在10万到130万之间(每毫升脂肪)，细胞 存活率在65%到93%之间。细胞得率和存活率的差 异主要与酶的浓度、消化时间、吸脂部位、吸脂方 式等相关。〗仍等[71采用浓度为0.1%、0.2%的I型胶 原酶分别处理脂肪组织20、40、60 m i n，结果显示，用浓度为1%的胶原酶消化脂肪60 m i n时，细胞产量 最高。分别从人腹部、腰部、大 腿内外侧抽脂并分离S V F，大腿内侧的S V F细胞数量 明显高于其他供体区域，经过培养后，A D S C的细胞 数量在93.12%〜96.14%。T R1V I S O N N O等采用传统
的吸脂套管(直径3 m m，单端口)和微套管(直径2 _，5个端口)抽脂，微套管抽出脂肪颗粒更小，微套管分 离细胞数量(2.91x l〇5cells/m L)是标准套管分离S V F
细胞数量的两倍(1.38x l〇5cel l s/m L)。
临床分离S V F为获得足够的细胞数量，保证其 再生潜能，仍以手动分离为主。但是使用经典胶原 酶法分离S V F的细胞数量和细胞活力可能存在较大 的差异，操作熟练程度和操作时间可能是造成不同 批次之间效果差异的原因，并不适宜大规模处 理脂肪组织。
1.3基于胶原酶法分离设备
鉴于经典酶消化法诸多因素对S V F得率及细胞 活率的影响，以及临床使用安全性、有效性、可重 复性和质量控制考虑，相继开发了 一系列半自动/自动化分离S V F设备(表1)。这些半自动/自动分离设 备大多具半封闭/封闭分离环境，分离过程与实验室 手工分离流程相似，经胶原酶处理、离心、洗涤和 过滤的步骤获得S V F细胞。与手工分离不同的是，除提供封闭环，这些设备能通过调节剪切、乳 化、超声等参数优化脂肪组织的前处理过程，使脂 肪颗粒的粒径更小且均一化，降低脂肪组织粒径对 S V F得率和细胞活率的影响。
根据现有临床研宄报道，临床分离使用设备 以Celution®、G I D-S V F1®、A D S C Extraction Kit®、Transpose R T(T P U)®、C h a-Station®等为主，不同商 业化设备在每克脂肪/吸脂剂分离的细胞产量差别 100倍之多[1°]。Celution®系统是报道商用系统中 S V F细胞产量最高的分离系统之一，取得欧洲统一 (C O N F O R M I T E E U R O P E E N N E,C E)药品和医疗器 械销售许可，可实现床
旁，但目前还未经F D A批 准上市，国内尚无使用报道案列。G E N T I L E等_比
李智国等：基质血管组分(SVF)临床分离技术研宄75
Fig.l The process of classical enzymatic separation of SVF
较 /Celution®、M e d i-K h a n Lipokit和Fatstem®三种分 离系统，Celution*系统细胞产量(5x H)4ceU s/g)最高。
A R O N O W I T Z[丨0〗比较了 Multi Station、C H A Biotech C h a-Station、Celution 800*和 Medi-K h a n Lipokit四种 不同分离系统，Celution 800®的分离效果最佳，细胞 产量2.4><1〇5Cells/g，细胞活力为93%。G I D-S V F1® 核心结构是一个完全密闭的八角筒状结构，配套特 制离心机。可大规模处理脂肪，一次最多可处理500 m L脂肪，并且该设备可实时检测分离的产物内毒素 水平。A D S C Extraction Kit®更接近于人工分离方法, 取得的脂肪通过加入等体积酶液，放入37 °C培养箱 中慢速摇晃30 m i n，最后经过离心和大量的洗涤去 除酶液。Transpose R T(T P U)®系统通过模拟人工酶 消化分离S V F，包含一个自动处理室(用于组织消化、离心和洗涤）、两个注射器(用于加注胶原酶溶液和 接收初成品）和细胞滤器。C h a-Station s是一个半封 闭半自动的分离设备，有一个脂肪袋、振荡离心设 备、低速离心机、100 H m滤器、细胞计数器，该设 备可通过实时计数快速验证S V F的分离质量。韩国 Multi Station设备是一个开放手动处理系统，模拟人 工分离过程，设备包括一个振荡/加热
器、大容量高 速离心机，所有设备均被安置在一个带有微粒空气 过滤和紫外线的生物安全柜中。其他一些全封闭自 动化分离设备基于产品保密协议，未能到相关的 具体分离程序。
1.4基于酶消化法分离的SVF的临床用途
S V F作为A D S C分离的中间产物，相较于A D S C，无需培养，减少外源物接触，同时有助于维持A D S C 在体内的微态环境稳定。临床使用S V F多通过酶消 化法获得，应用于肌肉骨骼、关节、肌腱损伤、伤 口愈合、泌尿生殖系统以及心血管和呼吸系统疾病 领域，并处于不同的临床研究阶段。同时为达到疗 效最大化，S V F除单独使用外，也可配合富血小板血 楽(platelet-rich plasma,P R P)、纤维蛋白、常规手术 或药物等其他辅助手段，部分临床试验见表2。
2非酶消化法
酶消化法虽然在S V F的得率上较高，但其成本 也高，消化1g脂肪组织所用的符合药品生产质量管 理规范(G o o d M an u factu rin g P ractices, G M P)级别的 胶原酶成本为2美元至5美元，同时设备分离多采用 一次性耗材，仍存在有因胶原酶洗涤不充分而导致 的不良反应。此外易受监管，酶消化法处理不符合 美国食品药品安全监督管理局（F o o d and D ru g A dm in istra tio n, F D A) 和欧洲食品药品监督管理局 （E uropean M ed icin es A g en cy, E M A) 提出的“最低 实质性 操作”，认为酶消化过程可能会改变S V F的细胞生物 学结构特征|37%。因此，经酶消化法获取的S V F并未 被r o A和E M A
批准用于临床，而非酶消化的组织样 S V F(tissu e SV F, tS V F)和细胞样S V F(c e ll SV F, c S V F)则己获批用于临床。非酶消化法主要依赖于振荡、涡旋等机械破坏力对组织进行破碎，再通过离心或 过滤等方法获取S V F。
2.1 Nanofat
Nanofat是S V F的一种，与常规意义的细胞样S V F(c S V F)不同，被称为组织样S V F(t S V F)。
Nanofat
定心支片76
•综述•
Semi-enclosed and automatic Tissue Genesis, Inc
Tissue Genesis 7.02xl 〇5cells/g
80.70%
IcellatoH12'31
Biosafe
Enclosed and automatic Cytori Therapeutics Celution800/CRS f'0-"15><104 cells/mL 63.00%
Stempeutics Research Pvt. Ltd Stempeutron1'41 2.4xl05 cells/g 93.00%
Hurim Biocell, Inc Huricell
SundarRaj
Automated system'1 1.17x10s cells/g
90.00%
Biosafe Group SA
Sepax 2 '61 2.6M05cells/mL 62.00%Semi-enclosed and manual
Medikhan International, Inc
Lipo-Kit GT1'01
4><l 〇4 cells/g
72.00%
Eurosilicone
Puregraft 250(l7] 4.25x105 cells/g 77.45%
Open and manual
PNC International
Multistation101
1.lx 105 cells/g
N-Biotek, Inc Beauty Cell Cellthera,
Cellthera Kit I(I S ,
GeneWorld ADSC Extraction Kitt，9InGeneron, Inc
Transpose RT™ (TPU)1288.00%
Semi-closed semi-automatic
Cha-Station
Cha-StationM 〇11x 104 cells/g
Medikan International, Inc
STEM-XTM Enclosed and manual
GID Group, Inc
GID SVF-l™1211
7.19xl 〇s cells/mL 83.00%LifeCell Corporation Revolve System1221
Proteal Stem.pras with Duografter II "7】 5.35x 10s cells/g 69.30%
“•••”表示使用该设备分离的SVF 未检测细胞产量或细胞存活率。
洗车房
“…” means cell yield and cell viability of the SVF separated by the equipment are not tested.
表1基于酶消化法分离设备
Table 1 Separation equipments based on the enzymatic digestion
方法
公
司
设
备
名
称
细胞产量 细胞活力 i F
Method Company Devise Cell yield Cell viability Picture I I
H
£
■
£:
1_另準一
^
李智国等：基质血管组分(SVF)临床分离技术研宄 77
表2基于酶消化法临床分离方法
Table 2 Clinical separation method based on the enzymatic digestion
临床用途Clinical application 作者
Author
分离方法
Separation method
给药方式
Way of administration
临床阶段
Level of clinical
患者数量
Number of patient
Bone/Joint/Tendon BANSAL123】Open and manual SVF+PRP Case series level IV/i=10 injuries HONG1241Open and manual SVF Level II a i=16
KIM/CHOI 丨251Open and manual SVF+fibrous protein Case series level IV n=[7
KOH/KWON/Open and manual SVF+high level osteotomy Level II w=21
Kl[u]+PRP
a k[21]Open and manual cSVF+PRP+HA Case series level IV w=3 Chronic wounds CARSTEN[28)GIDSVF-1，SVF Case series level IV«=10 CERVELLI1291Celution®SVF+PRP Level
III/2= 10
HAN(301Open and manual SVF+fibrous protein Level II n=26 Urogenital injuiy MIZUSHIMA13'1Celution system SVF+fibrous protein glue Case series level IV n=6 ANDELKOV1321Celution®800SVF Case series level IV n=6 Cardiovascul/COMELLA1331Adipolase™SVF Case series level IV«=28 pulmonary diseases
Peripheral nerve injury MAUSKOP1341Open and manual SVF Case series level IV n=9 BRIGHT135丨Open and manual cSVF+PRFG Case series level IV
CALGAGNIl36]Celution*800SVF+fat transplantation Case series level IV n=5
通过乳化作用破坏成熟脂肪细胞，获得一种含有 c S V F和细胞因子的凝结物，在微整形领域具有较广 泛应用。Nanofat制备通过使用直径为1m m的锋利 侧孔的多端口3 _套管收集微型脂肪，之后在两个 10 m L的注射器中互推30次，直至脂肪变白成为液体 状，之后用无菌纱布过滤，滤液被称为N a n〇fat[3W()l。这种Nanofat能够直接注射和制备皮肤贴片使皮肤 自主吸收M，适用于面部皮肤老化修复和胸部重塑。Nanofat能充分保持A D S C的干性，适用于提高脂肪 移植物保留时间，但乳化过程产生过多的细胞碎屑 和油脂，会引发局部的炎症反应，c S V F相较于N a n ofat, 细胞富集程度更高, 避免炎症反应且更适用于局 部病灶的微量注射。
2.2基于非酶手动分离SVF
人工手动分离S V F是实验室常用的一种非酶分 离方法，采用离心、振荡、摇晃等方法破坏E C M释放 基质细胞，但是标准分离程序存在较大争议，分离的细 胞量因人而异，一些手动分离方法见表3和图2。离心 一般采用梯度离心法，速度控制在200 xg~500 x g，离 心速度需要控制在保持基质细胞的完整性，同时破坏 脂肪细胞的范围内。由于脂肪细胞破坏后会释放大 量油脂，需要充分离心洗涤，避免残留过多油脂而引 起机体发生炎症反应。机械振荡指使用高速机械振 荡的方法打破E C M对细胞的束缚。如11^0510等[421采用6 000次/m i n的高速振荡仪持续振荡6 m i n，脂源 性干细胞约占的总细胞数的5%。C H A P U T等[431采 用3 200次/m i n涡流6 m i n，最后涡流法细胞存活率仅 为酶解法的一半，但是细胞集落数量(colony forming unit,C F U)明显高于酶解组。
2.3基于非酶分离设备
在实验室手动分离的基础上，S V F的分离技术有 所改进，一些自动分离设备相继被开发(表4)。本文 把一些套装全手工分离设备也归类为半自动分离设 备，市场己经有一些设备/套组获得上市许可，但是 分离的S V F细胞数量、存活率、各类细胞比例程度 有较大差异，操作者熟练水平、脂肪质量、操作环 境是造成差异的主要原因。
T I R Y A K I等％采用自制封闭立方体装置分离 S V F，该设备结合了机械分离、缓冲培养和离心步 骤。
该设备含有一个三通立方体腔室，立方体三面分 别装载1 000 ^m、750 n m和500 n m的金属滤膜，该立 方体的三面出液口均为鲁尔口，可同时连接三个注 射器，滤膜从大到小顺序依次连续推动相应的注射 器，脂肪呈现乳糜状后离心取下层，即为S V F层。通 过对35例妇女脂肪进行自制设备机械消化处理和酶 消化处理脂肪进行对比，结果发现，酶消化细胞产量 (3.38x106ceUs/m L)高于机械消化(1.34x106cells/m L)，该自制设备保证了乳化操作的密封性，同时也是唯
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