doi：10.3969/j.issn.2095-3887.2021.03.005
惠文巧汤继顺章薇1，班谦2，朱德建陈胜1
(1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室， 合肥230031；2.安徽大学生命科学学院，干细胞及转化医学研究中心，合肥230031)
摘要:TLR4是天然免疫系统中的一种重要模式识别受体，可选择性地识别病原微生物而启动天然免疫，在宿主天然免疫和获得性免疫中具有重要作用。山羊TLR4基因与多种疾病相关，然而，目前在山羊上关于TLR4基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。采用CRISPR/cas9系统，首先设计TLR4基因的sgRNA片段，合成sgRNA核昔酸序列，构建同时表达sgRNA和Cas9D10A的质粒PYSY-sgRNA，连接并转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，最后对转化子进行验证，提取质粒并转染山羊成纤维细胞，通过测序进行敲除检测。结果表明：酶切和测序鉴定证明TLR4基因敲除载体构建正确。
说明采用CRISPR/Cas9构建的载体，可为后续研究TLR4在支原体肺炎感染的免疫应答分子机制提供理论依据。
关键词:CRISPR/Cas9；山羊;Toll样受体4；基因敲除
中图分类号:S827.2文献标识码:A文章编号:2095-3887(2021)03-0026-05
Construction and Evaluation of Goat TLR4Gene Plasmid by CRISPR/Cas9System
HUI Wenqiao1,TANG Jishun1,ZHANG Wei1,BAN Qian2,ZHU Dejian1,CHEN Sheng1
(1.Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering,Inst i t ute of Animal Husbandry and
Veterinary Medicine,Anhui Academy of Agriculture Sciences,Hefei230031,China;
2.Center for Stem Cell and Translational Medicine,School of Life Sciences,Anhui University,Hefei230601,China)
收稿日期：2020-12-10
基金项目：国家自然科学基金项目(31402048)；安徽省重点研究和开发计划(1804a07020115,1804e03020322,202004a06020043)；安徽省农业科学院创新团队项目(2020YL033)
作者简介：惠文巧(1986-)，博士，研究方向为分子遗传与抗病育种
通信作者：朱德建(1963-)，研究员；陈胜(1974-)，副研究员
[j].Anim Reprod Sci,2019,204：183-8192.
[14]Wang P,Gorter R P,de Jonge J C,et al.MMP7cleaves remyelina
tion-impairing fibronectin aggregates and its expression is reduced in chronic multiple sclerosis lesions[J].Glia, 2018,66(8)：1625-1643.
[15]Mishra B,Kizaki K,Koshi K,et al.Expression of extracellular matrix
metalloproteinase inducer(EMMPRIN)and its related extracellular matrix degrading enzymes in the endometrium during estrous cycle and early gestation in cattle[J].Reprod Biol Endocrinol,2010,8：60. [16]Abd El-Aziz E.The association between expression of Ki-67and
MMP-7proteins and lymph node metastasis in malignant salivary gland tumors[J].Egyptian Dental Journal, 2020,66(3)：1563-1569. 17]Heerspink H J L,Perco P, Mulder S, et al.Canagliflozin reduces inflammation and fibrosis biomarkers：a potential mechanism of action Abstract:It has been demonstrated that TLR4is an important pattern recognition receptor in the innate immune system,which can selectively recognize pathogenic microorganisms and initiate innate immunity,thereby
plays an impor-
for beneficial effects of SGLT2inhibitors in diabetic kidney disease
*+.Diabetologia,2019,62(7)：1154—1166.
[18]Elhai M, Avouac J, Allanore Y.Circulating lung biomarkers in
idiopathic lung fibrosis and interstitial lung diseases associated with
connective tissue diseases:where do we stand[j].Semin Arthritis
Rheum,2020,50(3)：480-491.
[19]Loreto C,Filetti V,Almeida L E,et al.MMP-7and MMP-9are
overexpressed in the synovial tissue from severe temporomandibular joint dysfunction[J].Eur J Histochem, 2020,64(2)：8-12.
[20]向光明，刘秋月，王翔宇，等•绵羊PER3基因组织表达及多态性
与季节性繁殖的相关性研究*]•家畜生态学报,2020,41(8)：
12-19.
tant role in the host's innate and acquired immunity.Goat TLR4gene is associated with a variety of diseases,however,few reports on TLR4gene knockout and related functions in goats have been published.In the present study,the CRISPR/cas9system was applied.First,the sgRNA fragment of TLR4gene was designed,the sgRNA nucleotide sequence was synthesized,and the plasmid PYSY-sgRNA expressing both sgRNA and Cas9D10A was constructed,connected and transformed li DH5x competent cells.Finally,the plasmid was isolated,transfected into goat muscle fibroblast cells,and TLR4was sequenced in different cells.Restriction digestion and sequencing proved that the TLR4gene knockout vector was constructed correctly.By constructing the vector by CRISPR/Cas9system:it would provide a theoretical basis for the molecular mechanism of TLR4in the immune response to mycoplasma pneumonia infection.
Keywords: CRISPR/Cas9;goat;TLR4;knock out
Toll样受体(TLRs)是机体天然免疫系统的一种关键模式识别受体，主要选择性地识别病原微生物，以启动机体的天然免疫应答，在宿主的先天性免疫和获得性免疫应答过程中发挥着重要的作用叫作为TLRs家族的主要成员之一，TLR4在宿主应答阴性菌及其LPS的免疫过程中发挥关键作用!2%&"。
CRISPR/Cas9系统存在于细菌和古生菌体内，主要通过CRISPR RNAs(crRNAs)结合Cas9蛋白，形成crRNA/tracrRNA/Cas9复合体来识别外源核酸，通过剪切DNA双链以沉默外源核酸表达，从而抵抗病毒和外源质粒的入侵叫人们利用这一机其开发成了一种基因编辑系统气相对于RNAi、ZFN和TALEN系统而言，CRISPR/Cas9编辑系统易操作、成本低且效率高，另外可同时编辑任意数量的基因叫目前，应用于细菌!7"、斑马鱼!*%叭小鼠大鼠［14%15\蚕跑及哺乳动物和人类各种细胞系［17%19］等。在山羊上，研究者对一些决定主要经济性状的基因如FGF5妙21"、MSTN凶等进行了研究，而就免疫基因而言，目前尚未见有关研究人员利用该系统对TLR4基因进行敲除的报道。因此，本研究通过采用CRISPR/Cas9系统构建TLR4敲除载体，为后续获得山羊TLR4基因缺失型细胞系、研究山羊抗病的免疫应答机
!材料与方法
1.1材料
Trans2K Plus DNA Marker购自全式金生物技术有限，CRISPR/Cas9n，
复合膜菌DH5a感受态细胞、T4连接酶、无内毒素质粒大提试剂盒均天根生化阳离子脂体Lipofectamine®2000(Invitrogen)。PCR引物由上海，尚生物合成1.2方法
1.2.1sgRNA靶点确定和引物设计根据山羊TLR4基因(GenBank：HQ263215.1)到CDS序列并分析其结构，根据该基因结构确定敲除位点，选择外显子序列输入到软件中，得到gRNA序列。并根据设计生成的sgRNA，设计并合成对应的引物Oligo，其如下:
F-TLR4-gRNA-L1:CACCGACTCATATTCAGCACC TGA
R-TLR4-gRNA-L1: AAACTCAGGTGCTGAATATGA GTC
3d打印玻纤F-TLR4-gRNA-R1:CACCGTCACAACAAACTCTTG TCAT
R-TLR4-gRNA-R1: AAACATGACAAGAGTTTGTTG TGAC
1.2.2CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建引物退火：1"L F-Oligo(100"M)，1"L R-Oligo(100"M),8"L YSY oligo 退火缓冲液，以上溶液混合于PCR管内，在PCR仪中以每分钟1.5a逐渐从95b降至22°C。
连接：0.5"L退火产物，1"L YSY线性化三合一CRISPR/Cas9n质粒，1"L T4连接酶，2"L5xT4Buffer，5.5"L Milli Q
转化：室温15min后用大肠杆菌DH5a感受态细胞(pfu!108)进行转化。
转化子验证：转化涂板后挑取单克隆进行10"L体系菌液PCR验证。
0.5"L菌液，0.5"L YSY验证正向引物，0.5"L R-Oligo，5"L Mastermix，3.5"L MilliQ。
PCR反应条件:Seg1为95f预变性2min;Seg2为94°C变性30s;Seg3为56°C退火30s;Seg4为2°C延伸30s; Seg2to Seg4运行35个循环;Seg5为72k再延伸10min ;
Se=6为4B 保存。
经PCR 初步鉴定为阳性克隆送至南京金斯瑞生物
科技有限公司进行测序。
菌液37D 过夜培养，无内毒素质粒大提试剂盒提取
质粒，并采用微量紫外分光光度计测定质粒浓度。
1.2.3山羊成纤维细胞转染分离山羊成纤维细胞，进
行体外培养，细胞培养参照 ㈣ ，再将质粒
和lipo2000制成悬液后转染细胞，荧光倒置显微镜下观
察转染结果。
1.2.4基因敲除检测通过单细胞克隆筛选，获得突变
细胞 ， 细胞 送至生物公司进行测序， 采用
DNAMAN 软件对其序列进行比较，分析其是否存在移码
突变，以确定是否敲除成功。
2结果与分析
2.1基因sgRNA 设计
在U6启动子驱动下设计的sgRNA 转录本RNA 序
列分别为：
7-gRNA-Lg1: GACTCATATTCAGCACCTGAAGG ； Z&#$-gRNA-Rg1: TCACAACAAACTCTTGTCATTGG 。
2.2 PCR 验证阳性克隆电泳图片
PCR 电泳结果显示：双质粒构建初步成功，详见图
1、图 2。
M
2 3 4 5 6注:Marker.Trans 2K Plus DNA Marker ，从下到上依次为 100 5p 、
250 5p 、500 5p 、750 5p 、1 000 5p 、3 000 5p 、5 000 bp ；2.阴性对照；3~6.
7-gRNA-Rg1 克隆
M
2 3 4 5 6
注:Marker.Trans 2K Plus DNA Marker ，从下到上依次为 100 bp 、
250 bp 、500 bp 、750 bp 、1 000 bp 、3 000 bp 、5 000 bp ；2.阴性对照；3~6.
TLR4-gRNA-Lg1 克隆
图$ PCR 验证7&#$-gRNA-Rg1克隆电泳图
图2 PCR 验证TLR4-gRNA-Lg1克隆电泳图
2.3测序结果
阳性克隆菌液送至金斯瑞生物
康q
技术有限公司测序，测序部分序列比对结果见图3和图4。
由图3可以看出，通过对比，发现！实际序列和
设计序列同源性达100%。
pYSY-CMV-Cas9n-U6-ZL#4-gRNA-L2-SV40-Neo
测序结果 对 3。
由图4可以看出，TLR4实际序列和设计序列同源
性达到100%。因此，通过以上序列比对，可确定目标质
粒构建成功。
pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-Egfp
测序结果 对 4。
化妆品柜台
TLR4~neo —TGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTCATATTCAGCACCTGAGTTTTAGAGCTAGAA-TLR4-neo 测序CTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTCATATTCAGCACCTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Consensus tggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgactcatattcagcacctgagttttagagctagaa
图3 TLR4-Neo 测序结果对比图
TLR4-GFP
-------------------------------------------------------------------------------------------TGGCTTTATATATCTTGTGG TLR4-GFP 测序
AATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGG
Consensus
tggctttatatatcttgtgg
图4 TLR4-GFP 测序结果对比图
TLR4-GFP TLR4-GFP 测序
961
971 981 991 1001 1011 1021 1031
AAAGGACGAAACACCGTCACAACAAACTCTTGTCATGTTTTAGAGCTAGA ------------------------------AAAGGACGAAACACCGTCACAACAAACTCTTGTCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG
Consensus
aaaggacgaaacaccgtcacaacaaactcttgtcatgtttctaga
2.4山羊TLR4MC1R基因的敲除质粒提取及转染山羊成纤维细胞
对山羊TLR4MC1R基因的敲除质粒进行提取并检4567,9：；明,pYSY-CM'-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo质粒浓度为130ng/^L,pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EFla-eGFP质粒浓度为209ng/^L。将构建成功的目标质粒转染山羊成纤维细胞，可检测到GFP表达（见图5），证实转染成功，表明该质粒可进入细胞内，且目的片段可表达。
2.5TLR4基因敲除检测
由图6可知，本研究所获得突变细胞株和正常细胞相比，其TLR4基因cds区存在碱基T的缺失移码突变，可导致该基因功能的完全缺失。
絮凝沉淀池图5山羊肌肉成纤维细胞转染
图6突变细胞株和正常细胞TLR4基因测序结果对比图
3讨论
CRISPR/Cas9系统，是新开发的一种新型的基因打靶系统，利用细菌或古生菌中存在的CRISPR簇，在其前导区的调控下转录成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9参与下加工成成熟的crRNA，cRNA和tracrRNA结合形成的复合物cRNA-tracrRNA与Cas9核酸内切酶结合，并引导其识别结合外源DNA特定序列，剪切DNA双链，沉默外源基因表达。而通过人工设计这两种RNA，改造形成sgRNA，足以引导Cas9对DNA的定点切割，从而实基因的沉默⑷。
关于TLR4基因功能的研究，目前多见于采用RNAi 的段。在，CRISPR/Cas9构建TLR4基因敲除小鼠模型◎，然而尚未见山羊TLR4基因敲除的。
本研究采用CRISPR/Cas9系统构建TLR4基因敲除载体，方法简单快捷，只需针对该基因敲除位点设计一个长约20bp的sgRNA，然后连接通用的Cas9基因即可，而采用ZFNs或TALENs进行基因敲除，
对每个基因位点编辑都需要设计和组装2个核酸酶，构建技术难度较大、构建。因，与统的ZFNs TALENs基因敲除技术比较而言，采用CRISPR/Cas9构建基因敲除为，进一步推广和实
。
另外，传统基因敲除，主要是应用基因重组原理通过插入突变和靶向技术使目的基因功能丧失，与ZFN和TALEN这两种人工核酸酶相比,CRISPR/Cas9系统中的Cas9作为切口酶，具有单链切割活性，可以在特定位置制造单链切口，这样基本不会弓【起非同源末端连接，从而高效地介导外源基因的定点敲入，或对基因组进行点突变，大大降低了非同源末端连接所带来的风险。
本研究构建的载体参考Ran等!2$啲双切口Cas9基因敲除技术，利用RNA导向的CRISPR-Cas9系统形成双切口，在未影响靶向切割效率的前提下大大降低了脱靶效应，提高了基因敲除效率。本研究构建的TLR4基因敲除载体为后续探究山羊抵抗疾病感染过程中先天性免疫应答机制提供了理论基础。
参考文献
[1]Jordan S A，Jackson I J.Melanocortin receptors and antagonists regu
late pigmentation and body weight]J].Bioessays，1998，20(8)：603-
606.
[2]Ollmann M M,Barsh G S.Down-regulation of melanocortin receptor
signaling mediated by the amino terminus of Agouti protein in Xeno-pus melanophores[j]j Biol Chem,1999,274(22)：15837-15846.
[3]Robbins L S，Nadeau J H，Johnson K R，et al.Pigmentation phenotypes
of variant extension locus alleles result from point mutations that alter MSH receptor function]J].Cell，1993，72(6)：827-834.
[4]Jinek M，Chylinski K，F o nfara I，et al.A programmable dual-RNA-guided
DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity]j].Science，2012，
3376096816-821.
5BurgessTDTJ.Technology aTCRISPRTgenome-editingTtool J.TNatTRevT Genet，2013,14(2)：80.
6CongT L，RanT FT A，CoxT D，etT al.MultiplexT genomeT engineeringT usingT CRISPR/Cas systems]j].Science，2013,339(6121):819—823.
[7]Jiang W，Bikard D，Cox D，et al.RNA-guided editing of bacterial
genomes using CRISPR-Cas systems J.Nat Biotechnol，2013，31
3233-239.
8Auer T O，Duroure K，De Cian A，et al.Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in!ebrafish by homology independent DNA repair [J].Genome Res，2013，24(1)：142-153.
9Chang N，Sun C，Gao L，et al.Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos]J].Cell Res，2013，23(4)：465-472. [10]Hwang W Y，Fu Y，Reyon D，et al.Efficient genome editing in
Zebrafish using a CRISPRCas system J.Nat Biotechnol，2013，31
3227-229.
11Wang H，Yang H，Shivalila C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering]J].Cell，2013，153(4)：910-918.
12Shen B，Zhang J，Wu H，et al.Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting J.Cell Res，2013，235720723.
13Zhou J，Shen B，Zhang W，et al.One-step generation of different immunodeficient mice with multiple gene modifications by CRISPR/Cas9 mediated genome engineering J.The International Journal of Biochemistry&Cell Biology，2014，46：49-55.
[14]Li W，Teng F，Li T，et al.Simultaneous generation and germline
transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems]J].Nat Biotechnol，2013，31(8):684-686.
[15]Ma Y，Zhang X，Shen B.Gene rating rats with conditional Allel esusing
CRISPR/Cas[j].Cell Res，2014,24(1)：122—125.
16Liu Y，Ma S，Wang X，et al.Highly efficient multiplex targeted mutagenesis and genomic structure variation in Bombyx mori cells using CRISPR/Cas9[J[.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2014，49:35—42.
17Cho S W，Kim S，Kim J M，et al.Targeted genome engineering in human cells with the Cas9RNA-guided endonuclease J.Nat Biotech-nol，2013，313230-232.
18Cong L，Ran F A，Cox D.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems J.Science，2013，3396121819-823. [19]Mali P，Yang L，Esvelt K M，et al.RNA-guided human genome
engineering via Cas9J.Science，2013，3396121823-826. [20]Wang X，Yu H，Lei A，et al.Generation of gene-modified goats targe
图像搜索ting MSTN and FGF5via zygote injection of CRISPR/Cas9system]J].
Sci Rep，138782015.doi10.1038/srep13878.
[21]阿力玛，高原，苏小虎，等.CRISPR/Cas9编辑绒山羊FGF5基因细
胞株的建立[J].中国生物工程杂志,2016,36(7):41-47. 22，，.CRISPR/Cas9MSTN 基因突变系统的构建[J].农业生物技术学报,2018,26(8)：1440-1448.
23Ran F A，Hsu P D，Lin C Y，et al.Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9for enhanced genome editing specificity J.Cell，2013，154(6):1380—1389.
[24]王蓉蓉•北山羊成纤维细胞体外培养体系的建立及特性分析[D].
呼和浩特：内蒙古大学,2014.
[25]郭洋，万颖寒，王珏，等.Toll样受体4(TLR4)基因剔除小鼠构建
及初步表型分析[J].2020,40(6)：1-9.
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议