高迪;沙磊
【摘 要】Many scientists are interested in interstitial cells of Cajal(ICC),since its discovery by Scientist Cajal using methylene blue and acidophilic silver stain in 1893.Initially,researchers focused on the morphology identification,subtypes and distribution in tissues of ICC.At present,the study of ICC is focused on its relationship with some diseases and the mechanism of its function.With the wide application of the patch clamp,mechanism of ion channel has become a hot topic.Switching of these channels regulates the excitability of ICC and participates in various stages of their physiological function.But because ICC contains a variety of ion channels,its complete mechanism is still unclear.%Cajal间质细胞(ICC)自1893年由Cajal利用亚甲蓝及嗜酸银染发现以来,引起诸多研究者的关注.最初,研究者主要研究ICC形态学的鉴定、在组织中的亚型及分布特征等.目前,针对ICC的研究主要集中在其与一些疾病的关系及发挥作用的机制.随着膜片钳技术的广泛应用,ICC离子通道调节机制的研究成为热点,这些通道的开关调节ICC的兴奋性,参与其生理功能的各个阶段,但由于离子通道的种类繁多,其完整的调控机制尚不明确.
【期刊名称】event2《医学综述》
【年(卷),期】2017(023)008
【总页数】5页(P1457-1460,1465)
【关键词】Cajal间质细胞;离子通道;调控机制
【作 者】高迪;沙磊
【作者单位】中国医科大学药学院神经内分泌药理研究室,沈阳 110122;中国医科大学药学院神经内分泌药理研究室,沈阳 110122抛丸处理
【正文语种】中 文十字花封控
【中图分类】R333.3
Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)是一类特殊的间质细胞。ICC最初发现于胃肠道，因其与平滑肌细胞和神经紧密连接，引起了广泛的关注。ICC具有特殊的形态结构和
太阳能锅炉特异的表面抗原，为鉴别ICC提供了基础[1-2]。随着研究的不断深入，人们发现在胃肠道以外的组织中,如输精管、输卵管、尿道、膀胱、胆管等，也存在ICC或ICC样细胞，并且证明了ICC是这些器官运动的起搏细胞，参与调节平滑肌的慢波信号，维持组织的正常生理活动[1-4]。ICC的缺乏或功能的缺失与某些疾病的发生具有密切关系，如慢性前列腺炎[3]、急性胆囊炎[4]、膀胱梗阻[5]、胃肠道障碍[6]等。因此，研究ICC功能的发生机制具有重要意义。研究表明，ICC上存在多种离子通道，如钙离子、氯离子、钾离子通道等，这些通道的开放与关闭影响着ICC的活性与功能[7]。目前，研究主要采用免疫组织染法双染ICC和离子通道，以确定ICC表达某种通道；再利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和免疫印迹法定量；最后通过电生理技术研究各个通道的开关对于细胞的调控作用[8-9]。现对ICC的一般生理特性和ICC离子通道的研究成果加以整理并予以综述。茶子粉
1.1 ICC的形态与鉴别
1.1.1 ICC的结构特征 ICC是以网状结构分布的一类特殊间质细胞。在光镜下，ICC呈纺锤形或三角形，细胞质较少，核大且呈圆形或椭圆形；有细胞突起，并相互交织成网络[1]。随着电子显微技术的应用，人们研究发现ICC更多的结构特征。Garcia-Lopez等[10]将在电
镜下观察的ICC的超微结构概括为：细胞膜上存在许多穴样小凹，胞质富含线粒体、中间丝，微丝、微管、游离核糖体含量较少，高尔基体发育较好，胞质含有滑面内质网、粗面内质网。
1.1.2 ICC的鉴定方法 研究初期，为了在光镜下观察ICC的形态，多采用甲基蓝、嗜酸银染等方法，但这些方法均缺乏特异性[1]。随后，大量研究发现ICC中表达酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,c-Kit)蛋白，可利用c-Kit抗体标记ICC[1-2，10-11]。该方法具有较高的特异性，尤其是在消化道中，只有ICC及肥大细胞表现为c-Kit阳性，且这两种细胞形态差异大，可以加以区分[2]。目前，c-Kit染已成为公认的鉴定ICC的方法：经c-Kit抗体染后，结果为阳性，且具有特定细胞形态的细胞，可被确认为ICC。然而c-Kit染仍存在一些缺点：①并非所有的ICC都表达c-Kit，如人类小肠的深肌丛ICC[10]，Tamada和Kiyama[11]也发现W/Wv小鼠结肠中含有与ICC超微结构相同但c-Kit染为阴性的间质细胞；②除ICC外，还有其他细胞，如肥大细胞、神经元、神经胶质细胞等也表达c-Kit。
有研究者发现一种钙激活氯通道(anoctamin 1,Ano1)可以用来标记ICC。通过Ano1和c-Kit抗体在人类和小鼠的胃、小肠和结肠中的染结果可知，Ano1可以标记各类型的ICC，并
且具有很高的特异性[12]。与c-Kit相比，在小鼠结肠ICC定量上Ano1免疫染更具有优势，并且c-Kit染为阳性的肥大细胞不表达Ano1[13]。
1.2 ICC的分类、分布 在胃肠道中，分布于不同的位置上的ICC形态及空间结构也存在差异，据此，ICC共分为5种亚型。①浆膜下ICC：细胞呈星形，仅存在于小鼠小肠和结肠的浆膜层；②肌内ICC：可分为环行肌ICC和纵行肌ICC，主要发现于胃和结肠平滑肌层；③肌丛ICC：为多级细胞，呈网状分布于环行肌和纵行肌间；④深肌丛ICC：与其他ICC不同的是，其胞突沿着圆周生长；⑤黏膜下层ICC和黏膜下丛ICC：多为疏松的网状结构，多在胃和结肠的黏膜下层存在，介于结缔组织和环行肌层之间，平行于相邻的环行肌细胞生长[14-16]。
国内外很多研究均以新鲜分离的ICC为研究对象，新鲜分离的ICC较适用于实验周期较短的研究，而对于需要较长时间处理的实验则需要对ICC进行体外培养。因此，如何进行ICC的体外培养，稳定地保持细胞特性，对于在细胞水平上研究ICC的功能作用及其机制至关重要。目前，研究者主要采用的实验动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，提取细胞的组织来源有胃、小肠、膀胱、胆囊等[17-20]。
2.1 ICC的原代培养 目前，ICC的体外分离多采用酶解法合并梯度离心技术。即在无菌条件下，取肠道、胃等组织，在保持组织活性的同时，去除内容物，并在显微镜下剥离黏膜及黏膜下层，分离得到肌肉组织，用含有Ⅱ型胶原酶的消化液处理组织块，再进行密度梯度离心，获得最终的细胞悬液，接种于M199培养基(含有胎牛血清、重组鼠类干细胞因子)中培养。通过倒置显微镜观察细胞形态特征和c-Kit免疫染鉴定细胞是否为ICC[17]。宁海恩等[18]在上述ICC提取方法的基础上，对提取条件进行优化。在无菌条件下，取大鼠胃窦组织，经Ⅱ型胶原酶酶解后，取得ICC混悬液，经梯度离心后，接种于含有大鼠同源血清的培养基中进行培养，并进行传代培养。通过镜下观察细胞形态以及c-Kit染均证实细胞为ICC，台盼蓝染确定细胞活力为90%左右。该方法选用大鼠同源血清代替胎牛血清，并未使用重组鼠类干细胞因子进行诱导，降低了实验成本及实验的繁琐性，同时同源血清为细胞生长提供了更为接近生理条件的环境。目前也有学者采用流式细胞仪和免疫磁珠法来纯化初步分离的ICC，以提高培养的ICC的纯度[19]。ICC的体外分离也可采用组织块培养法。与酶解法相比，该方法的优点是避免了胶原酶对ICC表面抗原的破坏，酶解条件造成实验结果的不稳定。但该方法对于组织块贴壁要求较高，且需培养1周后，组织块周围才可观察到梭形或菱形的细胞，2～4周后才可形成网络状结构[20]。
2.2 ICC的传代培养 目前也有研究者尝试对ICC进行冻存和复苏。取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，终止消化后离心，用细胞冻存液(血清与二甲基亚砜比例为9∶1)重悬细胞。冻存条件为：①-20 ℃，40 min；②-70 ℃，16 h；③最终放入液氮中长期保存。细胞复苏时，将冻存管迅速放入37 ℃水浴锅中，至液体完全融化，然后将细胞悬液迅速转移至培养瓶中，加入完全培养基，培养24 h后再换液[21]。
目前，已有大量文献报道ICC参与诸多疾病的发生、发展。早期主要是研究其与胃肠道疾病的相关性，如慢性传输型便秘、先天性巨结肠、功能性消化不良等[6]。随着对ICC研究的不断深入，研究者发现ICC还参与其他疾病的发生，如胆囊炎、胰腺炎、膀胱疾病等[4-5,22-23]。ICC调控疾病的机制主要有ICC数量的变化、细胞表面蛋白的异常表达及ICC形态结构、功能的改变等因素。
Huang等[4]发现在豚鼠急性胆囊炎模型中，胆囊ICC的形态、大小没有发生明显变化，而ICC的分布密度明显减少；并且ICC的减少与干细胞因子和c-Kit蛋白的表达减少有关。Huang等[4]的研究表明，胆囊ICC数量的减少是急性胆囊炎发病的一个重要起因。Feng等[22]发现，慢性结石性胆囊炎豚鼠的胆囊中ICC明显减少，当给予药物后，ICC增多，
病情好转。在膀胱过度活动症中，膀胱ICC上的超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide cation channel，HCN)表达异常增多，引起ICC兴奋性增强，增强膀胱憋尿肌的收缩活动，引起膀胱过度活动症[5]。Zhao等[23]利用c-Kit标记ICC，观察重症急性胰腺炎中ICC的变化，研究发现ICC数量显著减少，细胞间的网络结构消失。透射电镜结果显示，疾病组中ICC的超微结构发生显著变化：细胞核皱缩、突起减少或消失、细胞间隙增大、细胞整体形态不规则、神经-ICC-平滑肌细胞的连接也受到破坏。
目前，研究者通常运用电生理学、药理学和分子生物学等多学科相结合的方法，更为精准地研究细胞离子通道的种类、分布及作用等。大量研究表明，ICC上存在多种类型的离子通道，这些通道的开放及关闭对ICC的功能有重要的调节作用[7-9，24-36]。
miad5304.1 钾离子通道 已有大量研究表明，在ICC中存在许多不同类型的钾离子通道[8-9，24-25]。Wright等[8]通过膜片钳技术测定小鼠结肠ICC的单通道电生理活动，结果表明ICC上含有可被钾离子通道阻断剂XE-991阻断的电压敏感性钾通道；采用免疫荧光染法双染ICC和Kv7.5(电压敏感性钾通道的一种亚型)，确定肌内ICC为Kv7.5阳性；逆转录-PCR结
果也证实Ano1阳性的ICC Kv7.5也为阳性。Wright等[8]的研究证实了小鼠结肠ICC含有Kv7.5通道，被阻断后可以兴奋肌内ICC。Anderson等[24]同样在豚鼠膀胱ICC中发现钾离子外向电流，调节ICC的静息电位和细胞兴奋性，并证明该电流是由Kv7通道参与调控的。另有白新宇等[9]证明大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+-activated K+ channel，BK)对大鼠膀胱ICC的兴奋性也存在调控作用，实验通过蛋白质印迹和免疫荧光染证明膀胱ICC膜上确实含有ɑ、β1亚型的BK通道，利用膜片钳技术测定了分离培养的ICC上的BK电流，并通过钙荧光实验发现阻断BK电流后，细胞内钙离子增加，引起ICC自发地产生兴奋，即BK通道的下调可以增加膀胱ICC的兴奋性。另有研究证明，在小肠和结肠的ICC中存在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)敏感型钾通道，该通道通过调控钾离子内流使细胞静息电位维持在-70 mV。当ATP敏感型钾通道受到抑制时，细胞膜去极化，引起ICC钙离子内流，增加起搏频率及肌肉细胞的动作电位频率[25]。
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