生物酶催化生产L-多巴简介
1、L-多巴简介
左旋多巴（3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称 L-DOPA）的化学名称为 3,4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：
作为一种重要的生物活性物质，L-DOPA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。L-DOPA的衍生物—变压器油罐多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来帕金森氏病，而L-DOPAwep.qq可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴PD获得明显疗效。由罗氏公司开发，其制剂美多巴于1973年7月在瑞士首次上市。迄今为止，仍是帕金森病最有效的药物之一。
L-DOPA还可用来弱视；利用酪氨酸酶将L-酪氨酸转化，经L-DOPA形成黑素，可用于毛发染；此外，人们还发现L-DOPA有抗衰老的功效。 2、L-多巴的合成方法
1911年，Casimir Funk在实验室中第一次成功合成 D,L-DOPA。1913年，Marcus Guggenheim从蚕豆豆荚中第一次分离提取到天然存在于植物体内的L-DOPA。目前，L-DOPA主要通过从植物中提取、化学法合成以及微生物酶法转化等方法生产获得。
虽然猫豆等植物中存在的多巴都是左旋的，提取过程中免去了与手性异构体D-DOPA的拆分工艺，并且L-DOPA的提取得率也相应得到了一些提高，但由于受到原料来源少、产量小的限制，因而生产成本较高，从植物中提取L-DOPA难以大规模生产，远不能满足市场需求。 上世纪70年代初，国外化学法合成L-DOPA的年产量已达150吨，但由化学法所合成出来的产物是D-型和L-型的混合物，而D-DOPA会引起人体毒性反应，因此应用于医学临床之前必须通过控制旋光度的方法来减少D-DOPA的影响。解决此问题的最好办法是使D-型和L-型多巴完全分开，但D-型和L-型多巴的拆分非常困难。 与从植物中提取及化学合成相比，微生物酶法生物合成 L-DOPA,具有生产周期短、可连续
大批量生产等优点。2005年世界 L-DOPA 年产量为250吨左右，其中大部分是通过微生物酶法生物合成的。
3、本项目技术介绍
酪氨酸酚裂解酶，又名β-酪氨酸酶，以PLP为辅酶，TPL 可以催化 L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在 TPL 催化下生成 L-DOPA。
本项目技术将编码TPL的基因片段转入大肠杆菌中进行高密度发酵表达，从而获得大量酪氨酸酚裂解酶。以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物，经TPL催化反应生成L-多巴。 目前本项目技术指标发酵24h左右湿菌重100g/L左右，生物转化反应20h左右，产物浓度50g/L左右。工程菌的构建和发酵、转化工艺均还在优化中，技术指标仍有提升空间。
4、纠偏机成本估算
指标：转化反应投菌量为6%，产物浓度弹跳高跷50g/L，转化率90%，纯化收率80%。发酵菌体湿重（粗酶）为120kg/t左右。1t发酵液成本（包括原料、人工及能耗）为2400元左右。
表1 1T转化反应液成本估算
试剂 | 单价（元/Kg） | 用量（Kg） | 总价（元） |
邻苯二酚 | 27.5 | 31.02 | 853.05 |
丙酮酸 | 50 | 24.81 | 1240.5 |
硫酸铵 | 1.0 | 37.23 | 37.23 |
sis压片湿菌体 | 20 | 60 | 1200 |
合计 | | | 3330.78 |
蜗轮滚刀L-多巴 | | 40 | |
| | | |
如上表，最后得到40kg产品，成本约为83.27元/kg（包括发酵全部成本、转化反应原料成本），其余包括分离纯化成本及能耗、人工等成本也按83.27元/kg计算，即L-多巴的生产成本估算为166.54元/kg。
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