作者：孔鑫李光荣刘靳波
侧流免疫层析（lateral flow immunochromatography assay，LFIA）是⼀种基于抗原、抗体免疫反应的经典床旁检测技术（point of care testing，POCT）。最初，研究⼈员采⽤纳⽶⾦制备层析试纸条，⽤于尿⼈绒⽑膜促性腺激素检测，即我们熟知的胶体⾦。但检测结果依赖⼈⼯判读，且检测灵敏度低、假阴性率⾼。随后，⼀些对层析膜进⾏简单图像采集、处理的仪器相继出现，LFIA结果判读实现⾃动、半定量化。 近年来，LFIA不断发展，检测性能得到很⼤提升，已逐步向定量检测过渡，其可检测样品多样（如全⾎、⾎浆、汗液、唾液，尿液等），并且能对核酸进⾏检测 [ 1] 。本⽂综述了LFIA检测系统的研究进展以及LFIA的商品化应⽤现状，以期为相关领域提供参考。
⼀、LFIA结构及定量检测
侧流免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、层析膜、吸⽔纸和聚氯⼄烯（polyvinyl chloride，PVC）底板五部分组成。单克隆抗体和⼆抗被预先固定在层析膜上以形成测试线或对照线，加⼊含待测物的样品后，待测物与结合垫上的标记抗体结合，随层析作⽤进⼀步被固定在T线上的单抗捕获。过量的标记抗体被C线上的⼆抗捕获，通过特定检测仪器读取T/C 线上的标记物信号强度，并代⼊预先绘制的标准曲线，在保留LFIA优点的同时实现了LFIA对待测物的定量分析 [ 2] 。
对于完整的LFIA定量检测系统⽽⾔，标记物、层析膜、检测仪是保障定量结果快速、灵敏、准确的基础。在近⼗年⾥，已研发出不同信号类型的灵敏标记物以及多种新型层析膜材料，还设计了⼀系列价格合理、结构紧凑的检测设备⽤于免疫层析结果的记录和量化。特别地，为保证定量结果溯源性，对试验中所使⽤的标记物、耗材、试剂、仪器及检测程序均可开展量值溯源⼯作，以使LFIA产品的检测结果溯源⾄国家或国际标准。可⽤经典的蛋⽩和分⼦检测⽅法，作为验证LFIA诊断效能的参⽐⽅法，如酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等 [ 3] 。
LFIA实现定量检测使得检测结果不受主观因素制约，⼤⼤提⾼了其在即时检测领域的应⽤深度与⼴度。下⽂就实现LFIA 定量检测的三个重要组成部件即标记物、检测仪器、层析膜以及取得的应⽤进展进⾏详细阐述。
⼆、LFIA检测系统进展
（⼀）⾼灵敏标记物
纳⽶标记物的成功应⽤使LFIA迈向定量检测的新台阶，根据标记物产⽣的信号不同，将其⼤致分为三类：（1）有⾊型标记物：会产⽣⾁眼可见的颜⾊；（2）荧光型标记物：在特定光源激发下可产⽣荧光；（3）其他标记物：包括纳⽶酶、磁珠等，分别产⽣酶学信号、磁信号。 1．有⾊型标记物：
纳⽶⾦（aurum nanoparticles，AuNPs）在⽔溶液中由于表⾯静电作⽤呈胶体状态，具有优异的理化性质且易于功能化，是LFIA中最常⽤的标记物。但AuNPs存在粒径分布宽、稳定性差、储存条件⾼的不⾜。近年来，已有研究采⽤油相合成、化学键合等⽅法来对AuNPs进⾏增强、组装、聚合，如⼆维⿊磷 [ 4] ，改良后的AuNPs既保留了原有特性，稳定性⼜得到很⼤提升，在微量药物、病毒糖蛋⽩的定量检测中，显⽰出⼴阔的应⽤前景。
碳纳⽶管（carbon nanotubes，CNTs）是由⽯墨烯⽚组成的⽆缝空⼼管状体，具有⾼⽐表⾯积、良好的机械强度和化学惰性。另外，⾃⾝⿊⾊使AuNPs具有很强的辨识度，因此CNTs的灵敏度⽐AuNPs更⾼。但CNTs易于聚集，⼏乎不
载客电动三轮车学惰性。另外，⾃⾝⿊⾊使AuNPs具有很强的辨识度，因此CNTs的灵敏度⽐AuNPs更⾼。但CNTs易于聚集，⼏乎不溶于任何有机溶剂。在CNTs表⾯添加亲⽔性的共价官能团，可改善CNTs的溶解性局限，并获得更好的稳定性，尤其适⽤于⼩分⼦化合物和特定蛋⽩的定量检测 [ 5] 。
玻璃纸包装2．荧光标记物：
由于有⾊型标记物信号放⼤能⼒有限，现已将许多新型荧光材料⽤于LFIA的定量检测，常⽤的荧光标记物有量⼦点、镧系元素等。
量⼦点（quantum dot，QD）是⼀种半导体荧光纳⽶晶体，荧光强度⼤且稳定，其发光光谱可调、狭窄、对称，适⽤于微量物质的检测。单⼀的QD经过两亲聚合物修饰后，可制备成核壳型量⼦点，其稳定性更好、保存期更长。在肿瘤标志物和⼩分⼦药物的检测中，检测限（limit of detection，LOD）可低⾄5.8 ng/ml。以QD为标记物的LFIA，还适⽤于荧光猝灭的⽅法，较其他标记物具有更宽的线性范围，在感染性疾病诊断、肿瘤诊断试剂开发和药物监测领域前景可观 [ 6] 。
镧系元素（lanthanide elements，LE）具有原⼦态发射、长荧光寿命、窄发射光谱、宽斯托克斯位移的特性，常⽤作基于时间分辨的免疫分析，在⼩分⼦药物检测中，表现出良好的重复性，LOD⽐最灵敏的AuNPs低约100倍。但LE在⽔溶液中存在低荧光产量的缺陷，可将LE与纳⽶微球等载体结合，以增加荧光产量 [ 7] 。上转发光粒⼦（up-converting phosphor，UCP）是由稀⼟⾦属元素合成的晶体材料，和其他标记物相⽐，UCP具有独特的上转发光现象、低背景⼲扰和⾼稳定性，⾮常适合于检测成分复杂的样品，如尿液、唾液等。检测结果与培养法和PCR法⾼度⼀致，可在20 min 内检测10种⾷源性致病菌 [ 8] 。
荧光微球（fluorescent microsphere，FMS）通常由纳⽶微球包裹荧光材料或在其表⾯偶联荧光物质制备⽽成，具有良好的亲和性和⾼⽐表⾯积，⽬前已经制备出包含有机染料、QD、UCP等荧光材料的FMS。但FMS合成步骤复杂、产率低、成本⾼，仅在⽣物酶、⼩分⼦药物的检测中有研究报道 [ 9] 。
3．其他标记物：
拉曼散射（raman scattering，RS）指荧光物质的吸收光与发射光不等的现象，不同物质的拉曼散射不同，将拉曼分⼦与⾦属表⾯接触后可实现拉曼信号的放⼤，即表⾯增强拉曼散射（surface enhanced raman
scattering，SERS），SERS信号稳定、灵敏，可⽤于多重检测⽣物⼤分⼦蛋⽩、病毒、细菌，但对特殊检测仪器的依赖，使得SERS在实际应⽤中并不⼴泛 [ 3] 。超顺磁珠是具有磁性内核和活性基团表⾯的复合纳⽶材料，具有易分离、信号稳定等优点，其结果不受样品中有⾊成分的影响，在微量激素、肿瘤标志物、药物检测中具有良好的应⽤前景，但超顺磁珠需要磁检测器或巨磁阻传感器，在⼀定程度上限制了其应⽤ [ 10] 。纳⽶酶是⼀类具有多孔结构的双⾦属纳⽶粒⼦，具有⾼⽐表⾯积和特殊的酶催化性能，但纳⽶酶合成困难、需额外的显⾊步骤。与胶体⾦相⽐，纳⽶酶灵敏度提⾼了两个数量级，其LOD和线性范围与商业ELISA试剂盒相当 [ 11] 。
（⼆）检测仪器
1．⾦标检测仪：
针对不同标记物信号，需⽤不同的检测仪器。早期的免疫层析检测仪主要针对AuNPs设计，⼤多将T/C线的颜⾊信号转换成电信号或灰度图像，如光敏电阻法、图像处理法等，由于T/C线的宽度较窄，光敏电阻法的信号响应受到限制；图像处理法也存在对灰度图像的利⽤不充分的缺点。现已报道了多种新型⾦标检测仪，如光热成像分析仪、压⼒读数仪 [ 4,12] ，通过分析仪检测T/C线温度、⽓压变化，经过简单的数字转换就可以得到定量检测结果，灵敏度⽐光敏电阻法⾼68倍，有望应⽤于⽣物⼤分⼦检测。
2．荧光检测仪：
随着荧光标记物的⼴泛使⽤，其配套的荧光检测仪也在不断的更新发展，为LFIA的检测提供了⼀种简单、快速、准确和定量的⼯具，不仅具有量化和客观解释结果的优势，还可以⾃动存档和传输结果。现有的荧光检测仪主要有直接检测荧光强度和智能⼿机两种模式。
直接检测荧光强度：通过光电探测器从T/C线中获取背景和荧光信号并转换成电信号，是上述荧光标记物信号检测的主要⽅式，在⼤型医院中有⼴泛应⽤，但这种模式需要完整的机电、发射及检测系统，使得整套仪器笨重、复杂，不利于便携化和即时诊断。
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智能⼿机：采⽤智能⼿机⾃带的闪光灯和相机，可对荧光及化学发光信号进⾏激发和检测，使智能⼿机成为便携检测仪的新可能。You等 [ 13] 利⽤智能⼿机作为LFIA的检测器，配合相应的软件系统，可同时定量检测脑利钠肽与致瘤性2因
的新可能。You等 [ 13] 利⽤智能⼿机作为LFIA的检测器，配合相应的软件系统，可同时定量检测脑利钠肽与致瘤性2因⼦，LOD分别为17.46 pg/ml和29.92 ng/ml。现有的智能⼿机检测器具有良好的不同信号辨识度和检测微弱T/C线信号的能⼒，在疾病的家庭⾃检中具有极⼤的应⽤前景。
（三）新型层析膜
层析膜是进⾏层析作⽤的主要部件，对于保证免疫反应进⾏和实现多组分检测⾄关重要。膜背景发光、孔径⼤⼩及分析物通过膜的液体流速既是评价膜性能好坏的重要指标，也是研发膜材料的切⼊点。
1．减少背景发光：
⼤多数商⽤层析膜在可见光区域会产⽣明显的背景发光，其常见原因包括⾃发荧光、磷光和拉曼散射。在进⾏LFIA分析前，如何选择低背景发光的层析膜，是需解决的⾸要问题。Shah和Yager [ 14] 应⽤激发-发射荧光光谱来系统地表征膜材料的⾃发荧光，并评估背景发光对分析性能的影响。为开发⼈员筛选低背景发光层析膜提供了⼀个简单的框架，使⽤该框架可减少耗时的实验优化过程，在对甲型流感病毒核蛋⽩检测中，LOD较未使⽤该框架前降低50%以上。
2．优化层析膜：
现有的LFIA层析膜具有更少的背景⼲扰、更好的稳定性和样品利⽤率。已有多种膜材料通过改变层析膜的孔径来控制液体流速，从⽽提⾼LFIA分析灵敏度。如⽔凝胶-纸杂化材料可以增加待测物的反应时间；海绵具有良好的层析作⽤和亲⽔性；纳⽶纤维材料具有⾼⽐表⾯积、⾼孔隙率、互连的多孔⽹络和灵活的可修饰性。Yew等 [ 15] 在NC膜上喷涂聚⼰内酯形成疏⽔涂层，以提⾼靶标与⾦纳⽶颗粒之间的相互作⽤率，灵敏度提⾼了⼤约⼗倍。另外，在进⾏全⾎样品分析时，可将层析膜与分离装置结
合，以减少红细胞的空间位阻对待测物在膜上的流动造成的影响 [ 16] 。
三、LFIA在核酸检测中的应⽤
1．偶联适配体：
束胸衣⽬前⼤多数LFIA使⽤抗体作为靶标识别元件，但抗体的使⽤存在⼀些局限，如抗体成本⾼、热稳定性差、易受pH影响。由于适配体易于修饰且具有⾼特异性、稳定性，已有研究将适配体作为抗体的替代物⽤于LFIA，实现对核酸、蛋⽩质、⼩分⼦化合物的灵敏检测。与基于抗体的LFIA相⽐，适配体具有更⾼的灵敏度，适⽤于药物分析、疾病预防和靶向领域 [ 17] 。同时，基于适配体的LFIA存在⼀些不⾜：适配体由指数富集获得，过程较复杂，价格昂贵；易受到钩效应影响，造成假阴性结果；可⽤的适配体性有限，与免疫测定相⽐，基于适配体的检测仍不成熟 [ 18] 。
2．实现核酸检测：
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特异性核酸序列检测在医学诊断、⾷品安全分析和环境监测中具有重要作⽤。近年来，结合了LFIA与核酸检测的侧流核酸⽣物传感器（lateral flow nucleic acid biosensor，LFNAB）在⽣物分析和临床诊断中的应⽤显著增加，具有操作简单、不需要复杂的分析过程和特殊仪器的特点，成为POCT核酸分⼦诊断的新技术。
利⽤LFNAB进⾏核酸检测，通常需进⾏两个步骤，即靶分⼦扩增过程和试纸条层析过程，层析过程⼤多采⽤基于⽣物素-亲和素的夹⼼杂交法 [ 19] 。结合现有的等温扩增⽅法（如环介导的扩增）和信号放⼤法（荧光分析，电化学分析）可简化扩增过程、增加信号强度，使LFNAB具备了检测时间短、成本效益⾼的优点。Pavagada等 [ 20] 提出了⼀种⽆需扩增步骤直接检测内源性miR-150-5p浓度的LFIA⽅法，为LFNAB提供了新⽅向。LFNAB⽬前已实现对脱氧核糖核酸、16S核糖体核糖核酸、微⼩核糖核酸等核酸分⼦的快速、多重检测。但由于探针序列普遍较短，容易造成假阳性；夹⼼杂交法的设计、构造过程复杂，LFNAB的整体性能还有待提⾼。恶劣的太阳
四、商品化应⽤
为明确LFIA的实际商品化应⽤情况，在国家药品监督管理局官⽹进⾏国家医疗器械许可查询，以"免疫层析"为关键词进⾏检索，结果显⽰⽤于免疫层析的医疗器械共计1 249种，其中检测仪器43种（胶体⾦定量检测仪31种，荧光免疫层析仪12种），试剂盒1 206种（包含811种定量检测试剂盒，395种定性检测试剂盒）。在定量检测试剂盒中胶体⾦试剂盒共288种；荧光免疫试剂盒共514种；⾦磁免疫试剂盒共9种。另外，定量检测试剂盒可完成78个项⽬检测，包含炎性指标、肿瘤标志物、酶、激素等，其中有291种试剂盒可完成⼼肌损伤标志物的定量检测，225种试剂盒可完成炎症因⼦的定量检测。
现有的定量免疫层析试剂盒数量为定性试剂盒的2.1倍，荧光定量试剂盒数量是胶体⾦定量试剂盒的1.8倍，反映出LFIA 正由传统的定性检测向定量检测转变，并且更多使⽤荧光标记物。另外，炎性指标和⼼肌损伤标志物远多于其他检测项
正由传统的定性检测向定量检测转变，并且更多使⽤荧光标记物。另外，炎性指标和⼼肌损伤标志物远多于其他检测项⽬，因为这⼆者在疾病早期就可出现，并且疾病发病较急，说明检测项⽬设置更偏向实⽤性强、临床意义⼤的指标。
五、结论及展望
随着LFIA检测系统的改进与提升，其检测灵敏度不断提⾼，在疾病诊断、药物监测、⾷品安全等⽅⾯的应⽤愈加⼴泛。灵敏标记物的使⽤，显著放⼤了LFIA的检测信号；基于便携设备（如智能⼿机）的检测仪已研发成功，使LFIA的家⽤化成为可能；新型层析膜可有效减少背景荧光，使结果更加准确。实际应⽤中LFIA开始转向定量检测，包括核酸检测，使LFIA成为待测物分析的有效、精准、可信⽅法。相信不久，随着检测仪器的发展，层析膜材料的更新，更多灵敏标记物的应⽤，LFIA检测项⽬会更多、更普及；其操作⽅式会更加智能、便携、家⽤；定量结果输出也会更加快速、灵敏、准确。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
选⾃中华检验医学杂志, 2019,43(06)
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