膜片钳技术SOP
关键词：膜片钳
目的：
研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。 基本原理：
膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。
通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用
细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图背板制作
Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs医用呼叫器+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂：
根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。
主要仪器设备与材料：
1 屏蔽防震实验台(TMC 63-544)
② 数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China）
③ 微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④ 微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan）
⑤ 电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan吡咯烷酮羧酸锌）
⑥ 膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A）旋转式清堵机
⑦ 倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany）
⑧ 计算机（PⅢ 800）
9 A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A）
10 pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A )
实验对象：
兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。
实验环境：
常温（22oC）下进行, 湿度（70-80%）
操作步骤：
1.液体配制
主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，
所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（ 详见细胞的分离与培养SOP：LY-XJD-SYJS-014/015）
2.标本制备
膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，单独或联合使用，有些组织还要加用其它酶，如弹性纤维酶等。（ 详见细胞的分离与培养SOP：LY-XJD-SYJS-014/015）
3.微管电极的制备
一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在1~2μm之间，抛光与涂布液体硅酮树酯后，充灌电极液。
3.1微管电极拉制
电极经两步拉制，经过一次粗拉使玻璃管中间拉成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成两
根。调节第一步和第二部拉制时的加热线圈电流，就可得到所需要的尖端直径。拉制电极的毛细玻璃管(Hematocrit Tubes，Drummond,U.S.A.)长度约为75mm。首先设定电极两步拉制参数: 第一步为59mA，第二步为54mA; 然后将制备电极的毛细玻璃管固定于PC-10垂直微管电极拉制仪上。经过两步拉制后电极尖端直径约为1~2μm，充灌电极液后电极阻抗为2~4 MΩ。
3.2绝缘树脂涂抹
为了克服热噪声和封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容噪声，需要在微电极尖颈部（距微电极尖端50nm）的表面薄薄地涂一层硅酮树脂，将涂好的电极移放到镍铬电阻线圈制成的电炉上烘干待用。
3.3电极热抛光
将两步拉制成的电极置于MF-83微管电极抛光仪的垂直推进架上，在低倍镜下（15×4）到电极尖端和加热电阻丝，然后换成高倍镜（15×33）。将加热电阻丝和电极尖端调整到一个平面内，进行瞬间加热，可使电极尖平滑并烧去多余的硅酮树脂薄层，使电极尖端圆钝平滑有利于高阻封接的形成。
3.4电极液充灌
用注射器反向充灌，即用拉细的聚乙烯胶管从电极尾部插入到电极尖端，再注入溶液。充灌后用左手夹住电极使其尖端向下，用右手指轻弹电极排出电极尖端的少许气泡。
4.高阻抗封接形成
4.1在恒温条件下，将细胞贴壁良好的载玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以尽量减少电极进入浴液的深度，从而减少浮游电容；
4.2倒置相差显微镜下选择立体感强、活性好的细胞进行实验；
4.3使用新拉制的微管电极，用细塑料管以反充灌方式灌电极液入电极尖端，若含有气泡，可手持微电极使其尖端朝下，用手指敲弹几下管壁即可排除，然后再将微电极安装在探头上。
4.4当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时，用注射器向电极施加一正压（1~2cm H2O），以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放大器上散堆填料pipette
offset气泡垫旋钮，将电极电压补偿到零。同时由膜片钳放大器向微管电极发放—电压为5mV、波宽40ms的方波脉冲信号，用于观察封接过程。
4.5微推进器将微管电极送入到即将接触细胞时，撤去正压，并继续向选定的细胞表面推进，当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变小，这时只要给微管电极尖端管腔内施加一负压（10~20cm H2O），若在计算机屏幕上看到应变电流突然下降至零，电流噪声随之减少，则提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘，其阻抗约10~100GΩ，说明高阻抗封接（giga seal）形成，这时的膜片为细胞贴附式膜片。在此基础上，根据不同的实验要求，再制成不同类型的膜片构型。
5.膜片钳制技术记录方式
5.1细胞贴附式膜片（cell-attached patch）
由于细胞牢固贴附于微管电极的尖端而得名。它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。
优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。
缺点：不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。
5.2内面向外式膜片 (inside-out patch)
细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。
特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。
应用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。
5.3外面向外式膜片(outside out patch)
细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。
优点：可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。
缺点：实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。
应用：可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。
5.4全细胞记录构型 (whole cell recording)
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