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微核

本科学生综合性实验报告

姓名学号 540001

学院生命科学学院专业、班级班

实验课程名称诱变物质的微核试验

教师及职称老师

开课学期 2016 至 2017 学年第二学期

云南师范大学教务处编印

实验室

实验时间

实验名称

诱变物质的微核试验

1、实验目的

（1）、了解微核发生的机制；

（2）、掌握微核实验的一般程序和实践意义；

（3）、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序、方法和注意事项；

（4）、掌握进行实验设计的一般程序和规则，学会用生物统计学方法对实验结果进行统计分析，并锻炼实践能力。

2、实验仪器及试剂

（1）、仪器和器械

离心机、生物显微镜、解剖剪刀、镊子、注射器、尖底刻度离心管、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。

（2）、试剂及配制

1）、小牛血清（灭活）

将滤菌的小牛血清置于56℃恒温水浴保温30min灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里。

2)、吉姆萨（Giemsa）染液（原液）

成分：Giemsa染料 3.8g、甲醇375mL、甘油125mL。

配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375mL和125mL甘油，混合均匀，放置37℃恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次，促使染料充分溶解，取出后过滤，两周后使用。

3）、0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）

成分：磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.64g/L（A液）

磷酸二氢钠（NaH2PO4 ·2H2O） 31.21g/L（B液）

配制：分别加蒸馏水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸馏水混匀，即为pH6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液。

4）、Giemsa应用液

配制：取2ml Giemsa染液原液与40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。临用现配。

（3）、实验动物

小鼠是微核试验的常规动物。体重一般为25g ~35g（也可选用成年大鼠，体重为150g ~200g）。正常小鼠嗜多染红细胞自发微核频率为2.6‰，阳性物（一般用环磷酰胺150mg/kg体重剂量）对照组微核频率为30.4‰。（斑马鱼微核频率范围为0.25‰ ~1.2‰ ）

3、实验原理、实验流程

实验原理

微核（Micronucleus，MN）：当染体受到损伤后，染单体或染体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染体，在细胞分裂后期，仍然游离在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。

微核试验（Micronucleus test，MNT）：凡能使染体发生断裂或使染体和纺锤体联结有损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起物难以鉴别。所以多用无主核的细胞来进行微核试验。

嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）：是分裂后期，处于幼年红细胞向成熟红细胞发展中间阶段的一红细胞。此时的红细胞主核已排出，但因胞质内含有核糖体，用姬姆萨染呈灰蓝；成熟红细胞的核糖体已消失，则被染成橘红；而幼红细胞则有较大的核，且被染成紫红。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核被染成紫红或蓝紫，很容易辨认，而且微核自发率低。因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞。

实验流程

选择试剂对小鼠进行腹腔注射（提前一天）；断颈法处死小鼠；取其股骨中的骨髓细胞；细胞悬液离心去上清液；涂片；固定；染；封片；观察并记录数据；分析数据并得出结论。

4、实验方法、步骤及现象

实验步骤：

4.1 剂量分组：

每种受试药物一般至少设3个剂量（见下表）。每个剂量组5-10只动物。另外，还应设溶剂对照（阴性对照）和阳性对照组。常用环磷酰胺作为阳性物对照，剂量可为40mg//kg体重（或150mg/kg体重）。如用斑马鱼（体重约0.5g，体长2.8~3.0cm ）测试水体污染物诱导微核的实验，则阳性对照物为氟化钠（NaF），剂量为30mg/kg 。一般为腹腔或腹部皮下注射。

4.2 染毒途径和方式:

染毒途径视实验目的而定，常用腹腔注射，24小时取材。

4.3 取材方法及制片观察

（1）骨髓的制取

①用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出(注意股骨的完整性)，擦净股骨上的肌肉。剪去股骨的髋面，将吸有0.85% Nacl生理等渗液小注射器的针头插入，反复数次吹出骨髓细胞(注意吹干净) 。反复吹打使其混合均匀，制成细胞悬液。

②将细胞悬液在1000转/分，离心5分钟，弃除上清液。

（2）涂片

在离心管中加入少量灭活的小牛血清（约0.3ml)混匀后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm ~3cm (涂片时一次涂成）。在空气中晾干。

（3）固定

将干燥的涂片放入无水甲醇液（或甲醇：冰乙酸=3:1的固定液）中固定5~10 min。即使当日不染，也应固定后于冰箱中保存。

（4）染

将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染20min~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。

（5）封片

用吸水纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层吸水纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。

6）观察与计数

先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无损，着适当的区域，再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞（主要为幼红细胞），但需用形态和染完好的有核细胞来做判断制片优劣的标准。

选择细胞完整、分散均匀，着适当的区域，在油镜下观察；以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准，计数1000个嗜多染红细胞中有微核的细胞数。

本法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa染法，嗜多染红细胞呈蓝灰，成熟红细胞呈粉红或橘红。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜性与核质一致，呈紫红或蓝紫，直径通常为红细胞的1/20～1/5。也有两个及多个微核的细胞。

微核率的计算

每只动物计数1000个嗜多染红细胞（也可以4个同学为一个小组，每位同学计数250个细胞），最后合并计算嗜多染红细胞数中含有微核的细胞数。微核率一般以“千分率” （‰）表示。

数据处理
利用统计学软件SPSS的单因素方差分析或 t 检验等方法，进行数据处理，分析实验结果（如下表）。　

5、参考文献

[1]孟紫强，阮爱东，桑楠等.SO2污染对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的诱发作用.环境科学，2002，23（4）123-125.

[2]孟紫强，桑楠，张波等.二氧化硫体内衍生物诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的效应.环境科学学报，2000，20（2）239-243.

[3]耿德贵，王秀琴，刘士旺等.除草剂使它隆对黄鳝细胞的致突变作用研究.环境与健康杂志，2000，17（2）103-105.

[4]周晓蓉，李百祥，邱向红等.小鼠骨髓及肝血中嗜多染红细胞微核率的比较.卫生毒理学杂志，1999，13（1）66-67.

[5] 曹佳.微核实验在中国的应用、发展与展望.遗传，2003，25（1）73-76.

6、实验数据处理

（1）实验现象

在高倍镜下观察，细胞有的完整、分散均匀，且有些区域着适当，但有的细胞还是有破损，且分散不均匀；在油镜下观察，少部分细胞能较好观察到的有核且形态完好，但是细胞有核的形态不好的依然占大多数。嗜多染红细胞呈灰蓝，成熟红细胞呈粉红。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜性与核质一致，呈紫红或蓝紫。

实验结果

①微核试验数据统计总表：

受试物	剂量 mg/Kg	组别	各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数
受试物	剂量 mg/Kg	组别	1	2	3	4	5	6	7	8
对苯二酚	120	1	38	33	35	37	34	35	36	30
	80	2	28	31	30	32	29	28	33	27
	40	3	20	25	21	23	28	26	24	22
秋水仙素	3	1	36	33	32	34	35	31	31	37
	1.5	2	29	25	23	26	24	27	25	24
	1	3	24	21	23	20	19	25	22	19
	3	1	22	25	免摇启动器20	26	21	23	22	18
	2	2	16	22	21	19	20	18	17	15
	1	3	13	17	15	16	14	15	17	13
阴性对照蒸馏水			3	2	1	4	3	5	3	9

②对苯二酚对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率：

	剂量（g/kg体重）	动物数（只）	受检细胞（个）	IT维保含微核细胞数（个）	微核率（‰）	P值
受试物对苯二酚	120	8	8000	278	34.75	<0.01
	80	8	8000	238	29.75	<0.01
	40	8	8000	189	23.625	<0.0125
阴性对照（蒸馏水）	40	8	8000	30	3.75	1

③秋水仙素对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率：

	剂量（g/kg体重）	动物数（只）	受检细胞（个）	含微核细胞数（个）	微核率（‰）	P值
受试物秋水仙素	3	8	8000	269	33.625	<0.01
	1.5	8	8000	203	25.375	<0.01
	1	8	8000	173	21.625	<0.01
阴性对照（蒸馏水）	40	8	8000	30	3.75	1

④对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率：

	剂量（g/kg体重）	动物数（只）	受检细胞（个）	含微核细胞数（个）	微核率（‰）	P值
受试物	3	8	8000	177	22.125	<0.01
	2	8	8000	148	18.5	<0.01
	1	8	8000	120	15	<0.01
阴性对照（蒸馏水）	40	8	8000	30	3.75	1

7、实验分析与讨论

（1）对实验现象的分析

实验中，在高倍镜下观察时：发现有的细胞还是有破损，且分散不均匀，这说明在滴片的时候滴片的高度不够或操作不当造成的，应该注重操作方法；发现有的区域着过浅，导致无法观察，这说明染的时间不够，或染的方法存在问题，或是滴片之前材料没有进行充分的润洗，残留的试剂对染这个步骤造成的影响，我们应该加长染的时间或改进染的方法或是将材料充分润洗，使其中的残留液基本完全润洗干净；还会发现有很多细胞会重叠在一起，这说明在滴片的时候没有把细胞砸开，或是在滴片之前的材料没有完全吹吸散开，这样的话我们应该注意每一个操作的细节，将每一个细节做到位。

（2）对实验结果的分析

①小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率的次数分布直方图

②单因素方差分析

经方差齐次性检验，P=0.965>0.05,说明方差齐次。

经单因素方差分析，F=127.450，P=0.000<0.01，说明差异极显著，即不同的试剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率极显著。

③多重比较表如下：

Multiple Comparisons

Dependent Variable: 微核率(‰)

二维码打印设备

	(I) 受试物	(J) 受试物	Mean Difference (I-J)	Std. Error	Sig.	95% Confidence Interval
	(I) 受试物	(J) 受试物	Mean Difference (I-J)	Std. Error	Sig.	Lower Bound	Upper Bound
LSD	对苯二酚120mg/Kg	对苯二酚80mg/Kg	5.00(*)	1.151	.000	2.70	7.30
		对苯二酚40mg/Kg	11.13(*)	1.151	.000	8.83	13.42
		秋水仙素3mg/Kg	1.13	1.151	.332	-1.17	3.42
		秋水仙素1.5mg/Kg	9.38(*)	1.151	.000	7.08	11.67
		秋水仙素1mg/Kg	13.13(*)	1.151	.000	10.83	15.42
		3mg/Kg	12.63(*)	1.151	.000	10.33	14.92
		2mg/kg	16.25(*)	1.151	.000	13.95	18.55
		1mg/Kg	19.75(*)	1.151	.000	17.45	22.05
		阴性对照	31.00(*)	1.151	.000	28.70	33.30
	对苯二酚80mg/Kg	对苯二酚120mg/Kg	-5.00(*)	1.151	.000	-7.30	-2.70
	对苯二酚40mg/Kg	6.13(*)	1.151	.000	3.83	8.42
	秋水仙素3mg/Kg	-3.88(*)	1.151	.001	-6.17	-1.58
	秋水仙素1.5mg/Kg	4.38(*)	1.151	.000	2.08	6.67
	秋水仙素1mg/Kg	8.13(*)	1.151	.000	5.83	10.42
	3mg/Kg	7.63(*)	1.151	.000	5.33	9.92
	2mg/kg	11.25(*)	1.151	.000	8.95	13.55
	1mg/Kg	14.75(*)	1.151	.000	12.45	17.05
	阴性对照	26.00(*)	1.151	.000	23.70	28.30
	对苯二酚40mg/Kg	对苯二酚120mg/Kg	-11.13(*)	1.151	.000	-13.42	-8.83
	对苯二酚80mg/Kg	-6.13(*)	1.151	.000	-8.42	-3.83
	秋水仙素3mg/Kg	-10.00(*)	1.151	.000	-12.30	-7.70
	秋水仙素1.5mg/Kg	-1.75	1.151	.133	-4.05	.55
	秋水仙素1mg/Kg	2.00	1.151	.087	-.30	4.30
	3mg/Kg	1.50	1.151	.197	-.80	3.80
	2mg/kg	5.13(*)	1.151	.000	2.83	7.42
	1mg/Kg	8.63(*)	1.151	.000	6.33	10.92
	阴性对照	19.88(*)	1.151	.000	17.58	22.17
	秋水仙素3mg/Kg	对苯二酚120mg/Kg	-1.13	1.151	.332	-3.42	1.17
	对苯二酚80mg/Kg	3.88(*)	1.151	.001	1.58	6.17
	对苯二酚40mg/Kg	10.00(*)	1.151	.000	7.70	12.30
	秋水仙素1.5mg/Kg	8.25(*)	1.151	.000	5.95	10.55
	秋水仙素1mg/Kg	12.00(*)	1.151	.000	9.70	14.30
	3mg/Kg	11.50(*)	1.151	.000	9.20	13.80
	2mg/kg	15.13(*)	1.151	.000	12.83	17.42
	1mg/Kg	18.63(*)	1.151	.000	16.33	20.92
	阴性对照	29.88(*)	1.151	.000	27.58	32.17
	秋水仙素1.5mg/Kg	对苯二酚120mg/Kg	-9.38(*)	1.151	.000	-11.67	-7.08
	对苯二酚80mg/Kg	-4.38(*)	1.151	.000	-6.67	-2.08
	对苯二酚40mg/Kg	1.75	1.151	.133	-.55	4.05
	秋水仙素3mg/Kg	-8.25(*)	1.151	.000	-10.55	-5.95
	秋水仙素1mg/Kg	3.75(*)	1.151	.002	1.45	6.05
	3mg/Kg	3.25(*)	1.151	.006	.95	5.55
	2mg/kg	6.88(*)	1.151	.000	4.58	9.17
	1mg/Kg	10.38(*)	1.151 金属净洗剂	.000	8.08	12.67
	阴性对照	21.63(*)	1.151	.000	19.33	23.92
	秋水仙素1mg/Kg	对苯二酚120mg/Kg	-13.13(*)	1.151	.000	-15.42	-10.83
	对苯二酚80mg/Kg	-8.13(*)	1.151	.000	-10.42	-5.83
	对苯二酚40mg/Kg	-2.00	1.151	.087	-4.30	.30
	秋水仙素3mg/Kg	-12.00(*)	1.151	.000	-14.30	-9.70
	秋水仙素1.5mg/Kg	-3.75(*)	1.151	.002	-6.05	-1.45
	3mg/Kg	-.50	1.151	.665	-2.80	1.80
	2mg/kg	3.13(*)	1.151	.008	.83	5.42
	1mg/Kg	6.63(*)	1.151	.000	4.33	8.92
	阴性对照	17.88(*)	1.151	.000	15.58	20.17
	3mg/Kg	对苯二酚120mg/Kg	-12.63(*)	1.151	.000	-14.92	-10.33
	对苯二酚80mg/Kg	-7.63(*)	1.151	.000	-9.92	-5.33
	对苯二酚40mg/Kg	-1.50	1.151	.197	-3.80	.80
	秋水仙素3mg/Kg	-11.50(*)	1.151	.000	-13.80	-9.20
	秋水仙素1.5mg/Kg	-3.25(*)	1.151	.006	-5.55	-.95
	秋水仙素1mg/Kg	.50	1.151	.665	-1.80	2.80
	2mg/kg	3.63(*)	1.151	.002	1.33	5.92
	1mg/Kg	7.13(*)	1.151	.000	4.83	9.42
	阴性对照	18.38(*)	1.151	.000	16.08	20.67
	2mg/kg	对苯二酚120mg/Kg	-16.25(*)	1.151	.000	-18.55	-13.95
对苯二酚80mg/Kg	-11.25(*)	1.151	.000	-13.55	-8.95
对苯二酚40mg/Kg	-5.13(*)	1.151	.000	-7.42	-2.83
秋水仙素3mg/Kg	-15.13(*)	1.151	.000	-17.42	-12.83
秋水仙素1.5mg/Kg	-6.88(*)	1.151	.000	-9.17	-4.58
秋水仙素1mg/Kg	-3.13(*)	1.151	.008	-5.42	-.83
3mg/Kg	-3.63(*)	1.151	.002	-5.92	-1.33
1mg/Kg	3.50(*)	1.151	.003	1.20	5.80
阴性对照	14.75(*)	1.151	.000	12.45	17.05
1mg/Kg	对苯二酚120mg/Kg	-19.75(*)	1.151	.000	-22.05	-17.45
对苯二酚80mg/Kg	-14.75(*)	1.151	.000	-17.05	-12.45
对苯二酚40mg/Kg	-8.63(*)	1.151	.000	-10.92	-6.33
秋水仙素3mg/Kg	-18.63(*)	1.151	.000	-20.92	-16.33
秋水仙素1.5mg/Kg	-10.38(*)	1.151	.000	-12.67	-8.08
秋水仙素1mg/Kg	-6.63(*)	1.151	.000	-8.92	-4.33
3mg/Kg	-7.13(*)	1.151	.000	-9.42	-4.83
2mg/kg	-3.50(*)	1.151	.003	-5.80	-1.20
阴性对照	11.25(*)	1.151	.000	8.95	13.55
阴性对照	对苯二酚120mg/Kg	-31.00(*)	1.151	.000	-33.30	-28.70
对苯二酚80mg/Kg	-26.00(*)	1.151	.000	-28.30	-23.70
对苯二酚40mg/Kg	-19.88(*)	1.151	.000	-22.17	-17.58
秋水仙素3mg/Kg	-29.88(*)	1.151	.000	-32.17	-27.58
秋水仙素1.5mg/Kg	-21.63(*)	1.151	.000	-23.92	-19.33
秋水仙素1mg/Kg	-17.88(*)	1.151	.000	-20.17	-15.58
3mg/Kg	-18.38(*)	1.151	.000	-20.67	-16.08
2mg/kg	-14.75(*)	1.151	.000	-17.05	-12.45
1mg/Kg	-11.25(*)	1.151	.000	-13.55	-8.95

* The mean difference is significant at the .05 level.

微核率(‰)

相片冲印

	受试物	N	Subset for alpha = .05
	受试物	N	1	2	3	4	5	6	7
Student-Newman-Keuls(a)	阴性对照	8	3.75
	1mg/Kg	8		15.00
	2mg/kg	8			18.50				聚氨酯改性环氧树脂
	秋水仙素1mg/Kg	8				21.63
	3mg/Kg	8				22.13
	对苯二酚40mg/Kg	8				23.63	23.63
	秋水仙素1.5mg/Kg	8					25.38
	对苯二酚80mg/Kg	8						29.75
	秋水仙素3mg/Kg	8							33.63
	对苯二酚120mg/Kg	8							34.75
	Sig.		1.000	1.000	1.000	.198	.133	1.000	.332
Duncan(a)	阴性对照	8	3.75
	1mg/Kg	8		15.00
	2mg/kg	8			18.50
	秋水仙素1mg/Kg	8				21.63
	3mg/Kg	8				22.13
	对苯二酚40mg/Kg	8				23.63	23.63
	秋水仙素1.5mg/Kg	8					25.38
	对苯二酚80mg/Kg	8						29.75
	秋水仙素3mg/Kg	8							33.63
	对苯二酚120mg/Kg	8							34.75
	Sig.		1.000	1.000	1.000	.105	.133	1.000	.332

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.000.

误差图如下：

（3）显微镜下观察到的结果

嗜多染红细胞微核

实验总结：

1、小鼠骨髓细胞微核试验结果为：嗜多染红细胞呈灰蓝，成熟红细胞呈粉红。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜性与核质一致，呈紫红或蓝紫。

分别用对苯二酚、秋水仙素和试剂作为染毒途径，每种试剂又分别有不同的浓度，并用蒸馏水作为阴性对照。共做了八组试验，根据每1000个细胞中所观察的微核数，分析数据说明所用的试剂造成的微核细胞数与阴性对照的有极显著的差异。

不同浓度的不同的试剂对小鼠骨髓细胞产生的微核率也有一定的差异，如：1mg/kg与2mg/kg、秋水仙素1mg/kg存在差异，而秋水仙素1mg/kg与3mg/kg、对苯二酚40mg/kg之间没有差异。

2、注意事项： ①最后在将涂片制成永久封片时，用注意所用的光学树脂胶应适量，过多容易使树胶溢出而容易沾在盖玻片表面而使制片清晰度下降，影响观察；②为保证 Giemsa 应用液的染效果应该先用现配； ③在对离心之后最终得到的小鼠骨髓细胞悬液进行涂片时必须一次涂成，而且用力要轻,否则会使细胞受到损坏,而且涂片不要过厚或过薄，以免影响观察； ④对于制作好的骨髓细胞涂片即使当日不染，也应该用 Giemsa 应用液固定后保存； ⑤注意微核与颗粒异物、嗜多染红细胞与其他骨髓细胞不同阶段血细胞的区分。⑥此次实验用于制片透明的二甲苯为有毒物质，在透明的过程中要即使将盖子盖好，注意不要将其泼洒在实验桌或者沾到皮肤，若出现池中情况应该及时用自来水冲洗； ⑦在实验过程中应防止小牛血清受到污染，胸骨须擦拭干净，以免影响结果配； ⑧对已经制作好的涂片进行制片质量的评定时，须以有核细胞形态、染完好作为判断制片优劣的标准，观察时选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染好的区域镜检，由低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检；

3、个人收获及经验：利用SPSS的单因素方差分析和 t 检验等方法进行处理和分析实验结果学习了统计学软件SPSS 的基本使用方法；经过此次综合性实验我基本上掌握了核实验的一般程序、对实验动物进行药物处理的腹腔注射法，了解到了微核实验的实践意义。

4、不足之处和改进：（1）在处死小鼠取股骨时，对形态解剖学不是很熟因此取骨髓遇到些问题。（2）在离心骨髓悬液涂片时浓度太高使得部分细胞堆叠未分开，计数嗜多染红细胞数不是特别明显，改进：稀释悬液，涂片均匀适当。（3）尚未掌握统计学软件SPSS 的使用方法，对利用SPSS的单因素方差分析或 t 检验等方法进行处理和分析实验结果的步骤也感到有些生疏。而SPSS是一个重要的生物学统计软件，因此需要在加强相关软件的使用技能。

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