两种硬性接触镜护理液除蛋白作用及生物相容性的比较研究 翁郁华;李伶俐;罗丽;南开辉;金婉卿;云
版税计算【摘 要】Objective To evaluate the biocompatibility of a new type of rigid contact lens care solution ( RCLS) including deproteinization effect, cytotoxicity on human corneal epithelium cells, irritation of eyes and skin, compared with MeniconProgent, a commercially available contact lens care solution. Methods The human corneal epithelial cells HCE-2 were planted in 96-well plates, co-cultured with RCLS, MeniconProgent and cell medium respectively. Cell viability was determined using WST-1 reagent to detect the absorbance of each well after exposure for different time at 450 ran; For deproteinization efficacy experiment, two groups of rigid contact lens were soaked in 2 mg/mL lysozyme solution for 24 hours, then immersed in RCLS or MeniconProgent for 30 min. The protein content of each solution was determined with BCA kit; The New Zealand white rabbits were chosen to take irritant experiment. Each rabbit had one drop testing solution in one eye. The result was recorded after experiment. The gauze pieces was steeped with RCLS or MeniconProgent before fixin
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g them onto the skin of rabbits' back, and the injury of the skin was evaluated. Results The RCLS had a 83. 159% deproteinization rate of lysozyme adsorbed upon the surface of lens,comparing to MeniconProgent of 85. 180% , which had no significant difference. Cytotoxicity results showed that MeniconProgent might lead to cell lysis which reveals a severe toxicity on corneal epithelium cells,and it also has irritating effect to eyes and skin. When co-cultured in RCLS for an hour, the toxicity of RCLS was less than 20% , neither irritating to the rabbit eyes nor to the skin. Conclusions RCLS had a superior biocompatibility comparing to MeniconProgent in regard to cytotoxicity and irratanting.%目的 将一种硬性接触镜护理液(RCLS)与现有同类产品MeniconProgent进行除蛋白作用、对人眼角膜上皮细胞毒性及动物刺激性的比较,综合评价其生物相容性.方法 细胞毒性实验采用人眼角膜上皮细胞,分别用培养液、RCLS、MeniconProgent作用细胞不同时间,以WST-1试剂检测细胞存活率；取硬镜RGP镜片在2 mg/mL溶菌酶溶液中浸泡、吸附24h,分别用RCLS和MeniconProgent浸泡吸附后的镜片,再用BCA法测定溶液中的蛋白含量；刺激性实验以新西兰白兔为实验对象,分别取0.1 mL RCLS或MeniconProgent滴入兔眼,记录眼损伤；取沾有RCLS和MeniconProgent的纱布块敷贴于兔背部裸露皮肤处,敷贴后评价皮肤损伤程度.结果 RCLS对硬镜表面吸附的溶菌酶有83.159％的除去率,相对于MeniconProgent的85.180％,差异无统计学意义；MeniconProgent接触15 min后即对人角膜上皮细胞有溶解作用,细胞毒性大,对兔眼有刺激,对皮肤也有轻度刺激,而RCLS作用人角膜上皮细胞1h,细胞存活率＞80％,对兔眼及皮肤均无刺激.结论 RCLS在细胞毒性及刺激性方面的生物相容性优于MeniconProgent.
【期刊名称】《中国眼耳鼻喉科杂志》
【年(卷),期】2013(013)002
【总页数】5页(P100-104)
压花器【关键词】硬性接触镜;护理液;除蛋白作用;生物相容性
【作 者】翁郁华;李伶俐;罗丽;南开辉;金婉卿;云
仿流明
【作者单位】温州医学院眼视光学院医院生物医学工程研究院 温州325027
【正文语种】中 文
接触镜又称隐形眼镜，有软镜和硬镜之分。硬性接触镜用于矫正屈光不正可以追溯到20世纪50年代。与软镜相比，硬镜的优点在于光学性能好、以矫正角膜散光、控制近视屈光度的增长［1］，用于矫正原发性角膜散光和各种继发性角膜散光（外伤所致的角膜散光、圆锥角膜、准分子激光屈光性切削术后散光等）［2］。
目前国内临床上应用的硬镜护理液种类很少，而且价格昂贵。由本院研制的一种硬性接触镜护理液（rigid contact lens care solution，RCLS），主要成分为三氟乙酸、聚氨丙基双胍，主要功能为除蛋白及清洁等。本文从除蛋白作用、细胞毒性以及动物刺激性方面，将其与同类产品美尼康清洁、除蛋白型硬镜护理液产品MeniconProgent作对比，评价RCLS的部分生物相容性，供临床应用参考。
1.1 实验材料
预应力混凝土管桩1.1.1 药物与材料 RCLS为无透明液体，pH值为6.8～8.5，本院研制；MeniconProgent由日本美尼康株式会社提供；氟硅丙烯酸酯角膜接触镜由温州欣视界科技有限公司提供。
1.1.2 试剂 溶菌酶（＞20KU，sigma）；2，4-二硝基氯苯（AR，西亚试剂）；生理盐水
注射液（浙江康乐药业股份有限公司）；WST-1细胞毒性测试试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；DMEM/F12、磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）、0.05％Trypsin-EDTA（gibco）。
1.1.3 实验动物 新西兰大白兔12只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄各半，由丹阳市光明实验动物养殖场提供，合格证号：3200002369。
1.2 实验方法
1.2.1 人眼角膜上皮细胞培养 所用细胞系为ATCC CRL-11135 HCE-2，37℃、5％CO2条件下培养，培养基为含10％FBS、5μg/mL胰岛素，10 ng/mL EGF，100μg/mL青-链霉素的DMEM/F12（1∶1）培养液，待细胞生长至80％～90％融合时以1∶3～1∶10比例传代培养［3］。
1.2.2 体外细胞毒性实验方法［4］HCE-2细胞融合后用0.05％Trypsin-EDTA消化5 min，相对离心力为400×g离心3 min。用含2％FBS的DMEM/F12（1∶1）培养液配制终浓度为5×104个/mL的细胞液，接种于96孔板，每孔100μL。
WST-1法检测细胞活性：实验分3组，正常对照组、RCLS组、MeniconProgent组（含A液和B液，使用时A液与B液等量混合）；每组设5平行，共6个时间点：15 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h。细胞培养18 h贴壁后，弃去原培养液，分别换成100μL的RCLS和MeniconProgent，对照组为等量新鲜培养液，分别在培养一定时间后用WST-1试剂检测各实验孔在450 nm吸光度（optical density，OD）值。计算细胞存活率=样品吸光度值/对照组吸光度值。
1.2.3 除蛋白功效实验方法 氟硅丙烯酸酯角膜接触镜27片，去离子水洗净烘干备用。配制2mg/mL溶菌酶溶液（溶液1），加入24孔板中，每孔2 mL，每孔放入3片镜片。模拟镜片在人眼内位置凸面向上放置，根据人眼眼表温度，将培养板置于34℃恒温孵育24 h［5］。
BCA法测定蛋白浓度。实验分3组：对照组、RCLS组、MeniconProgent组，每组3平行。各孔镜片在34℃孵育24 h后（溶液2），放入另一孔含等量PBS中漂洗一遍（溶液3）；再分别置于含有2 mL RCLS或MeniconProgent的新孔中，室温下浸泡30 min（溶液4），对照组以PBS代替；作用30 min后，每组镜片再依次用PBS漂洗2遍（溶液5）。BCA法分别
测定溶液1、2、3、4、5中溶菌酶的含量［6］。计算镜片吸附蛋白量：A=B-C-D（A：镜片吸附溶菌酶的量；B：溶液1溶菌酶的量；C：溶液2溶菌酶的量；D：溶液3溶菌酶的量）；计算两组护理液洗脱蛋白量：E=F+G（E：洗脱蛋白量；F：溶液4溶菌酶的量；G：溶液5溶菌酶的量）；计算两组护理液的除蛋白率：H=E/A×100％。
1.2.4 兔眼刺激实验［7-8］实验前1 d用1％荧光素钠染、裂隙灯检查兔眼，选择无任何眼病变及炎症的健康新西兰白兔6只。每只兔左眼下结膜囊内分别滴入0.1 mL RCLS或MeniconProgent，被动闭眼2 s。同法右眼作为对照眼，滴入等量生理盐水。分别在滴眼后1 h、24 h、48 h和72 h裂隙灯检查角膜、虹膜、结膜情况，拍照记录，根据国家标准GB/T 16886.10-2005眼损伤记分系统记分［9］。
1.2.5 兔皮肤刺激实验［10-13］新西兰大白兔6只，实验前一天将背脊两侧的毛用剃须刀剃去，约10 cm× 15 cm大小区域。取2.5 cm×2.5 cm大小的两层纱布块若干，每块纱布块滴加0.5 mL样品溶液浸湿，阳性对照物为质量分数1％2，4-二硝基氯苯（CDNB）的丙酮-橄榄油溶液（丙酮∶橄榄油=1∶1），阴性对照为等量的生理盐水溶液；将纱布块贴敷于兔子裸露皮肤处，纱布块上覆盖一层保鲜膜、两层干纱布，最后以医用透明敷料固定，敷用
时间6 h。连续敷5 d，在除去受试物后1 h、24 h、48 h、72 h观察皮肤反应。按照GB/T 16886.10-2005皮肤反应记分系统记分，根据刺激反应类型评价刺激强度。
1.3 统计学处理 运用SPSS19.0统计软件进行统计，实验数据均以均数±标准差表示；采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 细胞毒性实验 短期作用HCE-2细胞（15 min～1 h），RCLS组细胞均存活86.067％，细胞形态与对照组无异，呈梭形和三角形（图1）；作用2 h，细胞存活51.125％，因营养耗竭，细胞由伸展状态逐渐回缩变圆；作用时间延长至24 h时，细胞存活率逐渐降低，大部分都收缩变圆，但仍有11.685％存活。而MeniconProgent在作用初始15min即对细胞有腐蚀作用，使细胞解离成碎片，对细胞毒性极大。两组护理液作用不同时间细胞存活率，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。
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