两种曲酶糖化性质的比较研究
在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和于超颖,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总
之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。
米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。
1 材料与方法
1．1材料
菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4
1．2培养基
种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液体深层发酵液） 卡头1．3试剂
1．33%可溶性淀粉；碘液；0.01MNacl-HAC缓冲液；6NHCL；DNS试剂；葡萄糖标准溶液
1．4实验仪器
电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司，DK-8D）；721型分光光度计（上海欣茂仪器有限公司，2C409035）；立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂，LDZX-75KB)；恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司，DHP060)；气浴恒温摇床（太仓市实验设备厂，TCYQ）。
1．5方法
1．5．1菌种培养
斜面菌种培养：将米曲霉和黑曲霉分别接种于土豆汁培养基和察式培养基上，于30~32℃下培养4~7天，待产生孢子后置于5℃中备用。
军种扩大培养：从斜面培养基中挑取一环孢子接种于麸皮培养基上，于30~32℃下培养，待长满孢子后备用。
1．5．2液化酶和糖化酶的发酵生产
孢子悬浮液的制备：挑取经扩培的菌种孢子，接入内含10ml无菌水的试管中，制成孢子悬浮液，并在此基础上，继续稀释成108个/ml孢子悬液。稀释时可利用血球计数板推断选择适宜稀释度的孢子悬液。
液化酶和糖化酶的发酵:取5%孢子悬浮液接种于液体深层发酵液中，置于30~32℃，200r/min旋转式摇床上控温发酵，并定期测定酶活力，和PH。
1．5．3酶活测定
粗酶液制备；定期取20ml发酵液经纱布过滤，1000g冷冻离心5min，取上清作为粗酶液。
液化酶活性测定；取1.5ml 1.33%可溶性淀粉于60C水浴5Min，加0.5ml酶液（或双蒸水作为空白对照），60℃反应10min，取O.1ml反应液加入10ml碘液，摇匀后680nm处测OD。每个样品作两个重复。
糖化酶（葡萄糖淀粉酶）活性测定；0.1ml1.33%可溶性淀粉加0.1ml酶液（或双蒸水作为空白对照）60℃水浴反应20min，立即加入1mlDNS试剂，沸水浴5MIN后冷却，加入4.8ml水，在520nm处测定OD值。
葡萄糖标准曲线的制作
取9支25*25试管，分别按下表加入试剂；
葡萄糖标准溶液（ML） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
蒸馏水（ML） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS试剂（ML） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 |
|
将各管溶液混匀均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每官加入21.5ml蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测OD值。以葡萄糖MG数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
项目 | 空白 | 还原糖 |
| 0 | 1 | 2 | 3 |
发酵液溶液（mL） | 0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
蒸馏水（mL） | 2 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
DNS试剂（mL） | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| | | | |
加入试剂后，其余操作均于制作标准曲线时相同，测定后，取样品的OD值在标准曲线上查相应的糖量，用下式计算出发酵液中还原糖的含量。
还原糖浓度（mg/ml）=（还原糖mg数*稀释倍数）/乙烯基涂料发酵液体积
1．5．5发酵液PH测定
定期取发发酵液用酸度计测其PH。
3 2 结果与分析
4 2.1 两种酶活的测定
5 两种曲霉的液化酶和糖化酶酶活力如表1所示，米曲霉、黑曲霉的液化酶和糖化酶酶活基本都随着培养时间的增长而增加，酶活达到最大值后，随后酶活小幅度下降。实验结果表明，培养24h时黑曲霉的两种酶活低于米曲霉，但培养24h后 ，黑曲霉的化酶活性显著高于米曲霉的液化酶酶活性，而糖化酶酶活略高于米曲霉的糖化酶酶活。
6 表1 酶活力的变化
发酵时间（h） | 液化酶 | 糖化酶 |
米曲霉 | 黑曲霉 | 米曲霉 | 黑曲霉 |
24 | 90.239 | 55.416 | 0.563 | 0.549 |
48 | 94.332 | 98.929 | 0.545 | 0.566 |
72 | 980.479 | 998.111 | 5.382 | 5.485 |
mjpg96 | 984.257 | 996.851 | 5.344 | 5.405 |
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7 2.2 发酵液中还原糖测定及pH的变化
以葡萄糖含量为x轴，其OD值为y轴，制作葡萄糖标准曲线如图1所示，其回归方程为y=1.0139x-0.0616，R2=0.9937。将8个样品OD值代入葡萄糖回归方程中，计算得到其发酵液中的还原糖含量如表2所示。米曲霉所在发酵液中的还原糖含量随着培养时间的增长而减少，说明米曲霉吸收还原糖速率比还原糖的速率要快，而黑曲霉所在发酵液中的还原糖含量随着培养时间上下波动，在培养24h后，黑曲霉组发酵液中的还原糖增加且基本大于米曲霉组，说明黑曲霉的还原糖能力明显优于米曲霉。此外，还可以从表2中看出，两种曲霉均适应酸环境，但黑曲霉更耐酸。
8 图1 葡萄糖标准曲线
表2 pH、还原糖的变化
发酵时间（h） | 米曲霉 | 黑曲霉 |
pH | 还原糖（mg/mL） | pH | 还原糖（mg/mL） |
24 | 4.97 | 10.366 | 4.72 | 7.620 |
48 | 6.44流量生成 | 5.695 | 4.97 | 13.719 |
72 | 8.50 | 1.705 | 5.3 | 1.363 |
96 | 7.09 | 0.997 | 5.19 | 6.269 |
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9 3 讨论
10 曲霉属菌种是霉菌中较高级的类，在传统酿造业的应用已有数千年历史，包括酿酒在内的东方发酵食品主要利用了曲霉属中的黑曲霉和黄曲霉菌种，以及日本酿酒所利用的米曲霉菌种。本文以黑曲霉和米曲霉为实验菌种比较两株菌种的糖化性质。
11 本实验的结果表明两种曲霉的产酶活性都较高，生长速度快，适应范围广，但黑曲霉具
有比米曲霉具有更高活性的液化酶和糖化酶，且其酶更适应酸性环境，证实黑曲霉更适宜作为酒曲进行酿造。李宪臻等[3]于90年代研究过两株菌种的糖化性质，实验结果表明米曲霉具有远比黑曲霉高的液化酶活性和略高的糖化酶活性，黑曲霉的酸碱性适应范围广，这与本实验的结果不符，可能是由于米曲霉的液化酶和糖化酶的最适反应pH分别为6.0和4.0~8.0[4]，黑曲霉的液化酶和糖化酶的最适反应pH为4.0~5.0[3,5]，本实验发酵液的pH基本处于5.0而出现上下波动的现象，可能是由于曲霉进行物质代谢而导致有机酸性的沉积[5]和分解。此外，又因为米曲霉的液化酶和糖化酶最适宜温度为35℃[6]，黑曲霉的最适温度为28℃左右[7]，因此两者的糖化酶酶活十分相近，液化酶酶活则是黑曲霉的更高。此外，两株菌种的液化酶和糖化酶酶活在前两天都较低，第三天时显著上升达到最大值，经查阅文献，发现两种曲霉的液化酶和糖化酶的最适培养时间均为3天[1,6,7]，因此出现了以上现象。另外，两种曲霉发酵的过程一方面由于糖化作用而使发酵液中的还原糖增多，另一方面，曲霉的发酵需要消耗一部分还原糖，生成和消耗还原糖的速度不一致导致了发酵液中还原糖的波动不定。而两种酶的酶活差异以及其他蛋白酶和纤维素酶酶系的酶活[1]也进一步使两种曲霉发酵液中的还原糖含量产生较大的差异。
12 综上所失，黑曲霉具有很强的酶生产力和丰富的酶系，易培养，能够显著提高酿酒原料的利用率和出酒的质量，是酒曲微生物的重要组成部分。但其发酵条件不易控制[5]，发酵成本高导致企业的竞争力不高，今后的研究应集中在利用基因工程提高曲霉产糖化酶和液化酶的效率，为提高出酒率和降低酿酒成本提高依据。
13 Reference:
14 移动折叠屏风[1] Xie S C. Enzymatic property of Aspergillus oryzae for liquor-making. China Brewing,2009,(3): 132-134.
15 [4] Zhou L P, Sun B S, Chen X F. Study on the culture characters of some strains of Asp. Oryzae for liquor-making. Liquor-making Science & Technology,2004,(3): 30-32.
16 [7] Wu R R, Zhang Z M, Zhang Y H ect. Production of liquifying enzyme and glucoamylase by Aspergilus niger M2 in solid fermentation. China Brewing,2012,31(1): 107-110.
17 参考文献：
18 [1] 谢善慈. 酿酒用米曲霉酶活特性研究[J]. 中国酿造,2009,(3): 132-134.
19 [2] 李海梅, 马莺. 曲霉菌酶学性质的研究[J]. 中国酿造,2004,(7): 6-9.
20 [3] 李宪臻, 张宇, 金凤燮. 两株曲霉糖化性质的比较研究[J]. 食品与发酵工业,1994,8(6): 42-46.
21 [4] 周立平, 孙佰申, 陈旭峰. 酿酒用米曲霉若干霉株的培养特性研究[J]. 酿酒科技,2004,(3): 30-32.
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