透射电镜生物样品制作过程
透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染等步骤。 一. 取材
取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。 二．固定
以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%固定液，固定时间为2个小时。由于具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
杀螺剂 4、漂洗：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水
冷风门 为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和
水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。 1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。由于丙酮的脱水能力很强，所以在纯丙酮中的时间不宜超过10min。
四．浸透和包埋
包埋剂的配制：Epon 812树脂的配方一般沿用Luft 1961年的配方，冬季和夏季的配方比例不同，以夏季为例，配制10ml的包埋剂，其比例为：
6.2g Epon 812、4.5g MNA、1.4g DDSA。
待其充分混匀后，逐渐滴加0.15ml的DMP—30，再搅拌10分钟。
1.浸透：利用包埋剂和无水丙酮按一定的比例混合均匀，逐渐渗入到组织快中。利用无水丙酮与包埋剂的比例为1:1的混合液浸泡组织块，放在摇床上，时间为1小时。然后向混
合液中加入纯的包埋剂，使得无水丙酮和包埋剂的比例为1:2，摇晃均匀使得溶液充分的混合，后放到摇床上过夜。后将组织块浸泡在纯的包埋剂里，并将其放进真空箱里，使大气压抽到760托。半小时后将样品取出，并放置1小时。
2,、包埋：将事先放在65℃干燥箱内的空心胶囊取出，先其中滴加一滴包埋剂，然后将组织块从纯包埋剂中用竹签取出，放进胶囊中的包埋剂里，保证组织块位于胶囊的底部中央。然后再加入足量的包埋剂，但不能溢出胶囊。
3、聚合：组织块包埋好后，放进温度为65℃的恒温箱中聚合，实验室用的环氧树脂812在温箱中的聚合时间为1~2天，待包埋剂完全聚合时才可进行下面的操作。
注意事项:
(1)在配制包埋剂时，操作在玻璃操作箱内进行，箱内的相对湿度保持在25%以下。
(2)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀。
(3收腰羽绒服)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡。同时室内的湿度对包埋的效果有较大的 影响，因此在包埋时室内的湿度不宜过大。
(4)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净。
五．切片
1．修块:一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在特制的夹持器上，用锋利的单面刀片先削去顶端和组织周围多余的包埋介质，使其呈金字塔形（四面锥体形）。
2．定位：为了更容易的到所希望观察部位，进行超薄切片前先定位。利用普通石蜡切片机切厚度为1μm-2μm的半薄切片。将切下的片子转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，60~80℃下烫平烤干，用香柏油封片，在相差显微镜观察定位。再将包埋块放在显微镜下借反光寻与厚片相对应的位置，把表面修成梯形或长方形，使所观察的部位位于梯形或长方形的中央。梯形的底边一般为0.5mm，高为0.3mm左右。喉管
3. 超薄切片：
（1）对刀。对刀过程按一定的要求逐渐缩短标本切块顶面与刀口间的距离，使之尽可能的靠近，但绝对不能挨着。将定好位的样品夹在样品夹上，固定时使组织切面放正，再将装好液槽的玻璃刀安装在刀台上，并与刀台边的标尺等高，刀背与标本切面的夹角为2~5°。然后对刀，使标本的梯形上下底边与刀口平行，慢慢移动刀使其尽量靠近标本。
（2）切片。在液槽内注满蒸馏水或15%的酒精，调好切割速度，开启自动按钮，选择合适
的切片厚度。
4. 切片的收集：切片收集的关键是切片必须在载网的中心且不相互重叠，常用有贴片法和捞片法。以贴片法为例，将切片用眉毛针拨到一起，将有支持膜的一面朝下，从上到下对准切片轻轻的压下去，一接触到切片就提起，用滤纸吸干槽液后，放到洁净的培养皿中。
六．染
塑料炼油超薄切片的染就是利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使得细胞内各结构对电子产生强散射能力，从而增加发差。常用的染液有铀盐和铅盐，为了得到最好的反差效果，用铀盐和铅盐复合使用，先染铀再染铅。其方法是取一段窄的胶带贴在塑料条上，弃去塑料条面外多余的胶带，再把载有超薄切片的铜网依次粘在胶带的边缘上，然后将塑料条轻轻地插入到装有染液的滴定管中进行染，用封口膜贴住滴定管上端。最后利用输液器从滴定管的上端注入双蒸水，下端放水，通过流水冲洗方法把样品上残留的染液冲洗干净，可用输液器上流速控制器控制水流的大小，保证漂洗质量且不掉铜网。
具体步骤：unmsg先将粘有铜网的塑料条放进滴定管中，向其中加入铀盐溶液没过铜网，用胶带
封住上口。将滴定管放进25℃的恒温箱中，染30min。用双蒸水冲洗后，将塑料条转移到一个新的滴定管中，向其中加入铅盐溶液没过铜网，用胶条封住上口，放入25℃的恒温箱中，染10min。用双蒸水冲洗后，将铜网取下放进培养皿中。
七、电镜观察、拍片、记录等。
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