油九菊;柳敏海;殷小龙;李伟业;傅荣兵;徐志进
【摘 要】以东海带鱼为研究对象,利用高通量测序技术,分析了其肠道菌结构特征.测序结果共获得36 129条有效序列,聚类到245个OUTs,有效序列中有4条序列(0.01％)无法进行物种分类,其余分属于16个细菌门,共77个科、127个属.在门的水平上,相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria,52.30％),其次为厚壁菌门(Firmicutes,30.66％);在属的水平上,以弧菌科(Vibrionaceae,49.38％)的发光杆菌属(Photobacterium,47.90％)、梭菌科(Clostridiaceae_1,25.40％)的分节丝状菌(Candidatus_ Arthromitus,17.04％)为主.OTU稀释曲线逐渐趋于平缓,且覆盖率Good's Coverage指数为100％,表明样品测序深度足够大,OUT数量接近实际情况. 【期刊名称】涤绒《福建水产》
【年(卷),期】2018(040)006
硫酸钙晶须【总页数】7页(P434-440)
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【关键词】高通量测序;东海带鱼;肠道;菌结构
【作 者】油九菊;柳敏海;殷小龙;李伟业;傅荣兵;徐志进
【作者单位】浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000;浙江省舟山市水产研究所,浙江舟山316000
推力反向器【正文语种】中 文
【中图分类】S931
带鱼(Trichiurus haumela)是我国重要海洋经济鱼类之一，主要分布于西太平洋和印度洋，在中国沿海海域均有分布。东海带鱼是东海区海洋渔业中产量最高的主要经济鱼种，也是东海“四大海产”中唯一还能形成较大渔汛的传统捕捞对象，在东海渔业中占据举足轻重的地位。东海带鱼有春汛和冬汛之分，春季向北作生殖洄游，产卵时则洄游至浅海水域，带鱼产卵期很长，一般以4—6月为主，其次是9—11月。2017年7月，本单位率先在室内成功
开展带鱼人工驯养，填补了国内空白，在带鱼运输、保活、驯养等方面积累了宝贵的原创性经验。
鱼类肠道微生物是鱼体的重要组成部分，微生物、宿主及宿主所处的生态环境之间形成相互依赖、相互制约、又相对稳定的微生态系统，宿主为微生物提供了栖息环境，而微生物对宿主的发育、营养、免疫和生理健康等方面都起着非常重要的作用。目前关于带鱼的研究报道，主要集中在资源调查、种生物学、养殖技术等方面[1-5]，尚未见有关带鱼肠道菌的研究。自然界中很大一部分细菌是不能通过实验室培养而得到其纯分离物，传统培养法存在着较大的局限性，而传统分子生物学方法(如16S rDNA克隆文库、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳等)又存在通量低的缺陷。但16S rRNA高通量测序技术可以对微生物环境中落进行精确定量，具有通量高、错误率和成本低等特征[6-7]，已广泛应用于水体、土壤、动物等不同环境下微生物落结构的研究[8-9]。本研究利用16S rRNA高通量测序技术，初步分析了野生东海带鱼肠道菌结构特征，为深入了解东海带鱼的摄食特征、营养状况等提供参考，也为东海带鱼种质资源的保护和合理开发提供科学依据，以及为带鱼人工养殖技术研究提供理论基础。
1 材料与方法
二氧化碳减压器1.1 样品来源
样品于2017年5月初，采自舟山市六横岛台门海区，该海区潮流比较平缓，风浪适中，水深在6～9 m，海区底质以泥沙为主，盐度为23.0～27.5，溶解氧为6.5～8.2 mg/L。
1.2 样品采集
现场随机捕获野生东海带鱼50尾，平均全长31.5 cm，平均体重20.8 g，平均肛长12.4 cm。挑选其中活力较好、体表完整无擦伤、剖检内脏无病灶的5尾带鱼，用75%浓度酒精棉球擦拭体表，无菌条件下取出整条肠道，再用75%酒精棉球擦拭肠道外壁，灭菌手术剪剪开肠道，解剖刀刮取各肠道内容物，并混合为一个样品后，置于50 mL灭菌离心管中，灭菌生理盐水冲洗，清洗液与内容物一并保存于-80℃。
1.3 肠道菌总DNA的提取
茶油精按照Power Fecal DNA Isolation kit(MOBIO，USA)试剂盒说明书，提取肠道样品菌总基因组DNA。利用超微量核酸蛋白测定仪Merinton SMA4000 测定各DNA浓度及纯度，1.2%琼脂糖凝胶电泳检验核酸完整性。
1.4 PCR扩增及Illumina Miseq 测序
以样品菌总DNA为模板，采用引物343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′对微生物16S rRNA的V3～V4区进行PCR扩增。PCR扩增体系：10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Free)5 μL，25 mmol/L MgCl2+ 4 μL，dNTP 4 μL，正、反向引物各 1 μL，DNA模板 2 μL，Ex Taq 0.25 μL，超纯水补足50 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测后，利用E.Z.N.A.TM Cylcle-Pure试剂盒(Omega，USA)进行PCR产物的纯化及回收。纯化产物送至欧易生物医学科技有限公司(上海)进行Illumina Miseq高通量测序及分析。
1.5 数据处理及分析
对原始数据进行过滤处理，得到优化序列(Clean tags)，去除嵌合体后得到有效序列(Valid tags)，然后直接进行可操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)聚类分析。OTU分类为人为定义的分类单元，是在系统发生学或者体遗传学研究中，为了便于分析，人为给某一分类单元(品系、属、种、分组等)设置的同一标志[10]。对有效序列按照97%的相
似度进行OTU分类。基于OTU聚类分析结果，评估样本落测序深度；基于分类学信息，在各个分类水平上进行落结构的统计分析。
2 结果
2.1 肠道菌样品总基因组DNA质量检测
利用基因组DNA提取试剂盒，获取了带鱼肠道菌总基因组DNA，1.2%凝胶电泳结果如图1所示，电泳条带较清晰；经超微量核酸蛋白测定仪测定，DNA样品浓度为103.85 ng/μL，A260/A280为1.94，A260/A230为2.15，表明所获得样品总基因组DNA浓度较高，纯度、完整性较好。
注：M为DNA Marker；A、B为肠道菌样品。
Notes：M was 2 000 bp DNA ladder；A and B were intestinal flora samples.
2.2 样品测序质量分析
对Illumina 测序(MiSeq)得到的序列进行预处理，去除低质量的碱基序列以及模糊碱基序列，
共得到41 150条细菌序列，进一步去除嵌合体后得到36 129条有效序列(87.79%)，有效序列长度主要分布在401～450 bp之间，平均序列长度430 bp。以97%的序列相似度进行OTU聚类，共获得245个OTUs。由图2可知，在本试验的测序深度下，样品的稀释曲线趋于平缓，即随测序条数增加，获得的OTU数量变化不大，肠道样品序列覆盖率Good’s coverage指数为100%，说明本试验测序深度足够大，足以覆盖样品的大多数微生物，测序的数据量合理。
2.3 带鱼肠道菌分类组成
2.3.1 门分类水平上的菌组成
基于97%的相似度进行OTU聚类分析，统计肠道样品包含的OTU种类以及每个OTU中含有序列的比例。并且对每个OTU挑选出代表序列，同时将所有代表序列与Greengenes数据库[11]比对，通过RDP classifier[12]Naive Bayesian分类算法对代表序列进行分类注释。在245个OTUs、36 129条有效序列中有4条序列无法进行物种分类(0.01%)，其余244个OUTs分属于16个细菌门。如图3所示，东海带鱼肠道菌中相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria，52.30%)，其次为厚壁菌门(Firmicutes，30.66%)，此外拟杆菌门(Bacter
oidetes，8.43%)、蓝藻门(Cyanobacteria，3.30%)、梭杆菌门(Fusobacteria，1.68%)等也占有一定比例。
2.3.2 其它分类水平上的菌组成
从纲、科、属的水平上看，东海带鱼肠道菌主要分属于29个纲、77个科、127个属。在纲的水平上，以γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria，51.11%)和梭菌纲 (Clostridia，28.56%)为主；在科水平上，优势菌主要是弧菌科(Vibrionaceae，49.38%)，其次是梭菌科(Clostridiaceae_1，25.40%)；在属的水平上，发光杆菌属(Photobacterium，47.90%)和分节丝状菌(Candidatus_Arthromitus，17.04%)为主要的属。OTU优势度最高的10个纲、科和属见表1。
表1 东海带鱼肠道菌优势度最高的10个纲、科和属Tab.1 The first ten classes，families and genera of bacterial communities in intestinal flora of Trichiurus haumela序号No.菌种(纲)Strain species(class)相对丰度/%Relative abundance菌种(科)Strain species(family)相对丰度/%Relative abundance菌种(属)Strain species(genus)相对丰度/%Relative abundance1γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)51.11弧菌科Vibrionaceae49.38发光杆菌
属Photobacterium47.902梭菌纲 Clostridia28.56梭菌科Clostridiaceae_125.40分节丝状菌Candidatus_Arthromitus17.043拟杆菌纲Bacteroidia7.65紫单胞菌科Porphyromonadaceae3.65梭菌科未分类Clostridiaceae_1,Other5.144芽孢杆菌纲Bacilli1.84梭杆菌科Fusobacteriaceae1.56梭状芽胞杆菌1 Ostridium_sensu_stricto_13.215梭杆菌纲Fusobacteriia1.68肠杆菌科Enterobacteriaceae1.48紫单胞菌科Parabacteroides属2.216未知菌Other1.21肠球菌科Enterococcaceae1.41梭杆菌属Fusobacterium1.567柔膜菌纲Mollicutes0.87拟杆菌目_S24_7_group1.27肠球菌属Enterococcus1.418放线菌纲Actinobacteria0.72拟杆菌科Bacteroidaceae1.26拟杆菌属Acteroides1.269鞘脂杆菌纲Sphingobacteriia0.60普雷沃氏菌科Prevotellaceae1.26未知菌Other1.2110δ-变形菌纲Deltaproteobacteria0.33未知菌Other1.21卟啉菌属Porphyromonas0.96
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