『 摘 要 』： 近些年来，国内外相继研制开发出一些新型高、低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C/LDL-C）HDL-C、LDL-C的直接匀相测定法（homogeneous methods）试剂。如测定HDL-C用的选择性抑制法（PPD法），PEG修饰酶法（PEGME法），清除法（Clearance method）包括反应促进剂-过氧化物酶清除法（SPD法）和过氧化氢酶清除法（CAT法），免疫分离法（IS法）包括PEG/抗体包裹法（IRC法）和抗体免疫分离法（AB法）；测定LDL-C用的表面活性剂清除法（SUR法），过氧化氢酶清除法（CAT法），杯芳烃法（CAL法），可溶性反应法（SOL法）和保护性试剂法（PRO法）。这些方法因其简便、快速，易于自动化，已引起关注并广泛应用于临床常规分析。本文对HDL-C、LDL-C的测定方法进行了回顾，并重点介绍了各种匀相测定法的检测原理，以及临床测定时的技术要求。 『 关键词 』： 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 匀相测定法
众多流行病学与临床研究证实，动脉粥样硬化、冠心病的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平呈负相关，而与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平呈正相关。近年来国内外相
继研制开发出一些新型HDL-C、LDL-C的直接测定方法即匀相测定法(homogeneous methods)试剂，因其简便、快速，易于自动化，已引起关注并广泛应用于临床常规分析。
1 HDL-C检测方法
1.1 概述 测定血清HDL-C通常需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等应用超速离心法、谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将HDL与其他脂蛋白分离开，测定HDL组分中胆固醇含量。美国疾病控制与预防中心(CDC)测定HDL-C的参考方法为超速离心法，也为NCEP所推荐。CDC胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)近来选用了一种“指定的比较方法”(DCM法)作为转移CDC参考方法准确性的适用方法—硫酸葡聚糖-镁(DS50-Mg2+)沉淀结合ALBK法。谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。
国外把临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法分为3代。第1代为化学沉淀法，常用的沉淀剂为多阴离子，如磷钨酸(PTA)、DS、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇与某些二价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)合用。最早为美国国立卫生研究院(NIH)所采用的肝素-锰沉淀法，后多采用DS50-Mg2+法，欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg2+法胶水平台)和聚乙二
醇沉淀法(PEG法艾草精油提取设备)。但此类方法受高甘油三酯(TG)的影响。第2代采用简便的磁珠DS-Mg2+分离法(美国Reference Diagnostics和Polymedco 公司试剂)，省去了离心步骤，但需特殊装置，试剂不适于推广应用。第3代为匀相测定法，标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到NCEP 的分析目标，因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。国内情况与国外有些不同，也可分为3代。第1代为电泳法；第2代为化学沉淀法，1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2+法作为HDL-C测定常规方法；第3代为目前广泛使用的匀相测定法。
1.2 匀相测定法
1.2.1 选择性抑制法(polyanion polymer/ detergent HDL-C assay，PPD法) 亦称选择性遮蔽法。其应用两种不同的表面活性剂及多聚阴离子，根据脂蛋白的酶反应选择性，直接测定HDL-C。该方法的主要代表试剂盒为日本第一化学(Daiichi pure chemicals Co.)Cholestest HDL和美国Genzyme Diagnostics公司的N-genousTMHDL-C试剂盒。主要反应式如下：
1.2.2 PEG修饰酶法(PEG-modified enzyme HDL-C assay，PEGME法) 在Mg2+的存在下，α-环糊精硫酸盐与CM、VLDL、LDL形成可溶性复合物。这些复合物能抵抗变构酶 的作用；PEG6000或葡聚糖右旋糖苷与CHER和网络电视直播系统CHOD共价结合，引起酶的变构，变构酶对脂蛋白的大小和/或电荷具有选择性，其顺序依次为LDL＜VLDL≈CM＜HDL。而a-环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊状结构，从而避免酶的催化作用，这种作用还与Mg2+浓度有关。因此在Mg2+及少量DS 存在的前提下，可直接测定HDL-C。主要代表性试剂盒有日本协和(Kyowa Medex Co.)、罗氏诊断(Roche Diagnostics)和德国Centronic GmbH公司的产品。主要反应式如下：
1.2.3 清除法(clearance method)
1.2.3.1 反应促进剂-过氧化物酶清除法(synthetic polymer/detergent HDL-C assay , SPD法)
其原理为利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异。加入试剂Ⅰ，在反应促进剂(合成的多聚
物/表面活性剂)的作用下，血清中CM、VLDL及LDL形成可溶性复合物，它们表层的游离胆固醇在CHOD的催化下发生反应生成H2O2，在过氧化物酶(POD)的作用下，H2O2被清除。加入试剂Ⅱ，在一种特殊的选择性表面活性剂作用下，只有HDL颗粒是可溶的，所释放的胆固醇与CHER和CHOD反应，生成H2O2，并作用于4-AAP原体产生颜反应。代表试剂盒是日本第一化学新近推出的Cholestest N HDL试剂盒。主要反应式如下：
1.2.3.2 过氧化氢酶清除法(catalase HDL-C assay，CAT法) 其原理为试剂Ⅰ中具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL及LDL, 使其所含的胆固醇暴露，在CHER和CHOD的催化反应下生成H2O2，H2O2被过氧化氢酶(catalase)分解为H2O和O2 而被清除。试剂Ⅱ中的叠氮钠抑制了过氧化氢酶活性，另一表面活性剂使HDL颗粒中的胆固醇暴露，并与胆固醇酶试剂发生反应，用标准的Trinder反应即可测定HDL-C。应用两点速率法可减少高胆红素和高TG对测定结果的影响。代表试剂盒是日本生研(Denka Seiken Co.)和英国朗道(Randox Laboratories Limited)公司试剂盒。主要反应式如下：
1.2.4 免疫分离法(immunoseparation method, IS法)
1.2.4.1 PEG/抗体包裹法(International Reagents Corp HDL-C assay，IRC法) 为最早期由日本国际试药公司(International Reagents Co.)研制的试剂盒(测定过程包括4种试剂)。原理是先用低浓度的PEG4000包裹CM、VLDL、LDL，加入特异性抗apoB、apoCIII抗体，使CM、VLDL和LDL颗粒复合物凝聚，然后加入胆固醇酶试剂，用于检测上述复合物以外脂蛋白胆固醇(即HDL-C)，最后加入盐酸胍试剂，终止酶促反应和溶解含apoB脂蛋白复合物，以免其干扰吸光度测定。主要反应式如下：
1.2.4.2 抗体免疫分离法(antibody immunoseparation HDL-C assay ，AB法) 由日本和光制药公司(Wako Pure Chemicals Industry)新推出的试剂。其原理与上述方法相似。试剂Ⅰ中的抗人β脂蛋白抗体首先与血清中的CM、VLDL、LDL结合形成不溶性抗原-抗体复合物；加入试剂Ⅱ后，抗原-软膜布抗体复合物不与酶试剂起反应，只有HDL-C与酶试剂反应，生成H2O2，并通过Trinder指示反应测定HDL-C含量。主要反应式如下：
2 LDL-C的测定方法
2.1 概述 测定血清LDL-C通常需根据各种脂蛋白密度、颗粒大小、电荷或apoB含量等，应用超速离心法、谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开，然后测定LDL组分中胆固醇含量。目前尚没有真正意义的测定LDL-C的参考方法。CDC测定LDL-C暂定的参考方法为超速离心法(β-定量法/BQ法)，也为NCEP所推荐。此法测定的LDL-C，实际上包括脂蛋白(a)[Lp(a)]和中间密度脂蛋白(IDL)的胆固醇含量，也是评价其他检测方法准确性的基础。此法需昂贵的设备、操作复杂、费时且技术要求高，不易在普通实验室开展。Friedewald公式计算法是目前应用较广的估测LDL-C的方法，被NCEP推荐为常规测定方法。其以VLDL组成恒定(VLDL-C/TG =0.2，均以mg/dl计)的假设为前提，具有简便、直接、快速等优点。应用此公式计算LDL-C常受TC、TG和HDL-C变异的影响，总变异可达9.5%。但在血清中存在CM、血清TG＞4.52mmol/L (400mg/dl)、血清中存在异常β脂蛋白时[Ⅲ型高脂血症(HLP)]时不宜采用Friedewald公式法计算。谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。
国外将临床常规实验室直接分离测定LDL-C的方法分为3代。第1代为化学沉淀法，常用方
法为肝素-枸橼酸钠法、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和多环表面活化阴离子法等。这类方法主要缺点是TG水平较高(＞4.52mmol/L)时，有时因LDL沉淀不完全而使结果偏低。第2代方法有两类：一类为免疫分离法(immunoseparation method)，美国Genzyme Diagnostics和Sigma Diagnostics公司已有可供临床应用的直接测定LDL-C商品试剂盒。即用PEG和结合有羊抗人apoE、apoAI多克隆抗体的胶乳珠分离试剂除去HDL(含apoAI/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含lora通信apoAI/E)，直接进行LDL-C测定水平。此法精密度好，准确度高，特别是对于低LDL-C浓度的测定结果准确。与β-定量法有较好相关性，不受高TG水平的影响，可用于禁食或非禁食标本的检测。缺点是需专用分离管，试剂成本较高，难以自动化，且不适于冰冻或冻干标本的测定。可用于TG＞4.52mmol/L的少数患者LDL-C的检测，对于极少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的测定亦有一定应用价值。
另一类为简便的磁珠肝素分离法(美国Reference Diagnostics公司试剂)，此方法不需离心，操作简便，精密度高，与Friedewald公式法相关性好，与β-定量法结果一致。但此法所需标本量大，需特殊装置，特异性稍差，实验室较少应用此试剂盒。第3代为匀相测定法，标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面都可达到NCEP 的分析目标。国内也可分为3邬婧婧代，但与国外有些不同。国内第1代为电泳法；
第2代为Friedewald公式计算法与化学沉淀法，1995年中华医学会检验学会在国内推荐此法作为LDL-C测定的常规方法；第3代为目前广泛使用的匀相测定法。
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