1) 准备工作
电池充电座A.以下东西需160℃烘烤4hr以上:
5L大三角瓶一个(蒸馏水)
旋转机械故障诊断
试剂瓶两个(10×mops&20×SSC)
1L和100mL各一个
组合鞋架托盘一个
大培养皿一套
三角瓶一套(250mL及一小三角瓶,配胶使用)
B.电泳槽,制胶槽,梳子,挡板,用3%的双氧水浸泡2hr以上或过夜,加入双氧水后,用报纸包好,避免强光分解双氧水。(约需要800mL3%的双氧水) 太阳能灶2) 琼脂糖胶的配置
称取1.2g琼脂糖,加入80mL左右无菌水,微波加热,使终体积约为70mL,先将挡板用胶封好,然后待胶冷却到60℃左右,加入10mL10×mops和18mL37%甲醛,混匀后即可倒胶。
RNA(5μL,up to 20μg)——从-70℃取出后置于冰上自然解冻。
10×mops…………..………..2μL
提前混匀,然后加入到RNA样品中
37%甲醛…………………3.5μL去离子甲酰胺…………….10μL
EB(0.33mg/mL)……....0.2μL
将上述RNA样品于65℃水浴下处理10min,然后立刻置于冰上2min,加入2.5μL10×loading buffer,轻轻拍打管壁混匀,离心将样品甩入管底。
4) 电泳
滚压刀具待甲醛琼脂糖胶彻底凝好后,在电泳槽中加入800mL的1×mops 缓冲液,用移液吹尽胶孔中的残胶(注意不要太用力,防止吹坏胶孔),然后用100V恒压预电泳约20分钟后,加入处理好的RNA样品,在同样的条件下电泳2-3hr。(电泳完毕后拍照,保存照片) *10×MOPS 缓冲液(甲醛凝胶电泳缓冲液;Sambrook et al.,2001)
3 (N啉)丙磺酸(MOPS),pH 7.0 200mM
NaAC冯代存 50mM
EDTA 10mM