抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法-（2154） 抗氧化酶（ SOD、 POD、 CAT ）活性测定方法铝条板吊顶
一、超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制www.99ctct
（1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS ， pH7.8) ： A母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14） 71.7g；
B母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01） 31.2g。
分别用蒸馏水定容到 1000ml 。
0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至1000ml 。加入 10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000： 267～ 268。
（2） 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：取 1.399g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 100ml 。
网上说定容到 100ML 我也不懂。拜托
（ 3）100μ mol/L EDTA-Na 2溶液：取 0.03721g EDTA - Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；
（4） 100μM核黄素溶液：取 0.0075g 核黄素用蒸馏水定容至 100ml ，避光保存，随用随配，并稀释 10 倍
（ 5）750μ mol/L 氮蓝四唑（ NBT ）溶液：称取 0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；
酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml 。取 5ml 于 10000r/min 下离心
10min ，上清液即为SOD 粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
2、酶活性测定
2．显反应取试管（要求透明度好） 5 支， 3 支为样品测定管， 1 支为对照管，另外 1 支作为空白，按表39-1 加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min （要求各管受光情况
一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。
试剂（酶）
0.05mol/L 磷酸缓冲液
130mmol/L Met溶液
750μ mol/L NBT 溶液100μ mol/L EDTA-Na 2液20μ mol/L 核黄素
酶液
锅炉出渣机
蒸馏水
总体积表 39-1各溶液加入量
用量 (ml)终浓度（比时）
1.5
打印机共享器0.3
13mmol
75μ mol
0.3
10μ mol
0.3
2.0μ mol
0.3空白和对照管加缓冲液代替
0.05酶液
0.25
3.0
加核黄素时记得要快并且要避光，
SOD 活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm 波长下的消光度值，已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50%为一个酶活性单位表示。按
下式计算 SOD 活性：
( A 0 A S )V T
gmr传感器SOD 总活性 = A
00.5 FW V 1
式中SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg 蛋白表示；
A 0—照光对照管的消光度值；
A S—样品管的消光度值；
V T—样液总体积（ml ）；
V 1—测定时样品用量（ml）；
FW —样重（ g）；
蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g) 。
用荧光灯20w 照 20min 可以吗不可以,
二、 POD、CAT 酶活性的测定
粗酶液制备同SOD。
1、过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法）
（ 1）试剂配制：
100mmol/L 磷酸缓冲液 (pH6.0) ：分别取 A 母液 (Na2HPO4 ) 61.5ml 和 B 母液 (NaH 2PO4 ) 438.5ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M ， pH6.0) ；
（ 2）反应混合液配制：
取 50ml PBS(100mmM ，pH6.0) ，加入 28ul 愈创木酚（ 2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷
却后加入19ul 30 ％的 H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
（ 3）样品测定：
称取 1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以
液转入 100ml 容量瓶 ,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。
4000r/min离心15min ，上清
取试管 3 支，一支取3ml 反应液并加入磷酸缓冲液1ml 作调零，两支取3ml 反应液并加入 1ml 酶液，立即计时，在470nm 测定，酶隔30s 读书一次。测一个样加一个，不要全
部加上。（边加样边测定，测定前等待 5 秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加
好样到开始记时的时间相差不大）
（ 4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01 为1 个酶活性单位（u）。
POD= （A470× Vt） /（ W× Vs×0.01×t）(u/g min)
A470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g) ；t为反应时间(min) ； Vt为提取酶液总体积；Vs 为测定时取用酶液体积。
2、过氧化氢酶（CAT ）活性测定
（ 1）试剂配制：
0.2mol/L 磷酸缓冲液（ pH7.0）：取 A
混合后至100ml 。 (加 1gPVP)
母液 (Na 2HPO 4) 61.0 ml和 B 母液 (NaH 2PO4 ) 39.0 ml （ 2）反应液配制：吸取 5.68ml 30%的H 2O2（原液）稀释至1000ml，摇匀即可。
（3）样品测定： 1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 3ml 4 ℃下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置置研钵中，加入 2 ～25ml 容量瓶中，并
钢框胶合板模板4 ℃冰箱中静置
10min ，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。 4℃下保存备用 .
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