植物生理学与生物化学国家重点实验室（浙江大学）
实验室Protocol汇编
实验室主任：吴平
参编人员：寿惠霞，毛传澡，吴忠长，王首峰，莫肖蓉，刘洪家，易可可，李靖，黄方亮，周洁，何晓薇等
文本编辑：陈铭
(2005年12月15日)
©本实验室版权所有
一． cDNA文库构建方案
mRNA的纯化(PolyATtract mRNA Isolation systemIII Z5300)
准备：65℃水浴或heating block ；灭菌的无Rnase 1.5 ml 塑料试管；灭菌的无Rnase头
一．Annealing of probe
视觉定位系统
1．在一支干净的1.5ml 管中加入0.1-1.0 mg 总RNA，补无Rnase的水到500 ul；
2．65℃,10 min;
3．在RNA管中加 3ulBiotinglated-Oligo (dT) Probe 和 13 ul 20×SSC ，在适温下温和混匀，直到冷却，约要10 min；同时准备0.5×SSC和0.1×SSC.
二．Stock solution Preparation
1．在无Rnase试管中准备1.2 ml 无菌的0.5×SSC(30 ul20×SSC,+1.170ml Rnase-free water);
2．在无Rnase试管中准备1.4 ml 无菌的0.1×SSC(7.0 ul20×SSC,+1.393 ml Rnase-free water);
三．Washing of streptavitin paramagnetic particles
1．温和悬浮塑料试管中的颗粒至颗粒全部被分散，将小管放到Magnetic Stand 使SA-PMPS颗粒层积在管的一边（-30sec） 3．用0.5×SSC(每次0.3 ml)洗SA-PMPS颗粒三次，每次用Magnetic Stand 固定，小心移去悬液；
4．用0.1 ml 0.5×SSC 悬浮洗过的SA-PMPS颗粒颗粒。
四．Capture and washing of Annealed Oligo(dT)-mRNA hybrids.
1．将处理的RNA全部加入已经洗过的含SA-PMPS管中；
2．适温沉淀10 min，每1-2 min 温和地颠倒混合一次；
3．将SA-PMPS管放到Magnetic Stand固定，小心去处悬浮液，不要摇动SA-PMPS沉淀；
4．用 0.1 ×SSC 洗颗粒（轻轻将颗粒从管底弹起使所有颗粒悬浮）4次，每次0.3 ml;
最后一次洗颗粒后在不搅动颗粒沉淀的前提下尽可能去除悬浮液。
五．Elution of mRNA
1．用0.1 ml 无Rnase 水将洗过的颗粒沉淀轻轻弹起悬浮；
2．用Magnetic Stand 固定颗粒，将洗脱的mRNA 转移到灭菌的无Rnase 小管，不要将颗粒丢弃！
3．用0.15 ml无Rnase 水再次悬浮颗粒，重复capture步骤，将两次洗脱的mRNA汇总（0.25ml）.电泳检测。
六．mRNA的浓缩与检测
1．在mRNA溶液中加入 3M NaAc(pH5.2)，至终浓度0.3 M；混匀，加二倍体积的冰预冷的乙醇，混匀，冰上放置至少30 min；最好-20℃过夜。
2．4℃,10,000g 15min，小心弃去上清夜，用70%乙醇洗沉淀离心后在空气中晾干核酸沉淀，用少量无Rnase水溶解；
3．测OD和电泳检测，加三倍体积的乙醇混匀，-70℃保存备用。
备用方案：
1．加0.1倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）/1倍体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜；
2．室温，≥12,000g, 10min;
3．沉淀用1 ml 75%乙醇悬浮，再离心；
4．沉淀空气中干燥15 min，用无Rnase的去离子水悬浮，使浓度在0.1 – 1.0 ng / ul, 测OD确定浓度，-70℃保存；长期保存在乙酸钠/异丙醇中-70℃保存。
cDNA合成
CLONTECH
SMART TM cDNA
Library Construction Kit
User Manual
PT3000-1(PR92334)
Catalog#:K1051-1
一．cDNA第一链的合成
1．在一灭菌的0.5ml 离心管中加入下列样品：
1-3 ul RNA (0.025-0.5ug poly A+ or 0.05-1.0 ug total RNA)
zeidan1 ul SMART III Oligonucleotide
1 ul CDS III 3`PCR Primer
总体积为5 ul (不足时用去离子水补充)
2．稍作离心使样混合;
3．72℃ 2 min;
4．冰上冷却 2 min;
5．稍离心使样沉到管底;
6．加入下列样品（冰上操作）：
2.0 ul 5×First-Strand buffer大鼠解剖
1.0 ul DTT(20mM)
1.0 ul dNTP mix(10mM)
1.0 ul MMLV 反转录酶 (200U/ul)
10.0ul 总体积.
7．用温和混匀，稍离心;
8．空气浴 42℃，1 hr;
9．放到冰上终止反应;
10．吸取2 ul 用于LD-PCR；剩余-20℃可以保存三个月.
二．LD-PCR扩增-cDNA（冰上操作）
1．PCR仪预热到95℃;
2．取一PCR管，按下加样:
2 ul 第一链cDNA
80 ul 去离子水
10 ul 10×Advantage 2 PCR Buffer
2 ul 50×dNTP Mix
2 ul 5`PCR Primer
2 ul CDS III/3` PCR Primer
2 ul 50×Advantage 2 Polymerase Mix
100ul 总体积
生产数据采集
3．轻弹试管混匀，稍离心甩到管底;
4．放到预热的PCR仪上.
5．按下面程序做扩增:
GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600
95℃ 1 min 95℃20sec
x cycles x cycles
95℃15 sec 95℃ 5 sec
68℃ 6 min 68℃ 6 min
钢管自动切割机x cycles 的确定：
Total RNA (ug) Poly A+ RNA (ug) Number of cycles
1.0-
2.0 0.5-1.0 18-20
0.5-1.0 0.25-0.5 20-22
0.25-0.5 0.125-0.25 22-24
0.05-0.25 0.025-0.125 24-26
6．循环结束后，取5ulPCR样品电泳分析.1.1%琼脂糖,ds-cDNA应分布在0.1-4 kb.
7．继续下面程序或保存在-20℃.
三．蛋白酶K消化（可以用PCR产物回收试剂盒替代，更方便去蛋白和小分子）1．取一0.5 ml 管，加50ul ds-cDNA (2-3ug) ,2ul 蛋白酶K(20ug/ul)；
2．离心混合；
3．45℃,20min；稍离心；
4．加50ul ddH2O；
5．加100 ul 酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀1-2min；
6．14,000 rpm , 5min 分相；
7．取上层液体到另一干净的0.5ml管中，弃中间层和下层液体；
8．加100ul 氯仿/异戊醇，连续颠倒混匀1-2 min;
9．14,000 rpm , 5min ，使分相；
10．取上层液体到另一干净的0.5ml管中，弃中间层和下层液体；
11．加10 ul 3 M NaAc, 1.3 ul 肝糖元（20ug/ul）, 260 ul 适温 95% 乙醇。马上适温离心，14,000rpm ,20min.
12．小心去上清液
13．用100 ul 80%乙醇洗沉淀一次；
14．在空气中干燥10min，让乙醇蒸发；
15．加79 ul 去离子水悬浮沉淀。
四．Sfi 1 酶切
1．取一干净的0.5ml 管，按下配方加入试剂：
79 ul cDNA(见上)
10 ul 10×Sfi Buffer
10 ul Sfi Enzyme
1 ul 100×BSA
100 ul 总体积
2．混匀，50℃保温 2h
3．加2ul 1% Xylene cyanol 染料, 混匀。
五．用Chroma SPIN-400 将cDNA按分子大小分部（注意应该舍去小分子的分部）
1．取16支 1.5ml管，按顺序标号排列；
2．准备 Chroma SPIN-400柱：
A．从冰箱中取出Chroma SPIN-400管，适温预热至少1 h 。将柱子颠倒几次，使填料完全悬浮；
B．将柱子中的气泡赶走，用1ml 的温柔地悬浮填充物；注意避免产生气泡。
打开柱子底部塞帽，使柱中溶剂自然下滴。（如果柱子3 min后还无液体流出，将顶盖再盖一次，这种压力可使柱中溶剂流出）
C．将柱子固定；
支承板
D．让柱中贮藏的缓冲液按重力作用流出，直到露出填充物的表面。填充物的顶部应在柱子管壁的1.0 ml刻度处。若太少应补充（从其它柱子中取填充物；
E．液流的速度应在1滴每40-60 秒。液滴的体积应是每滴40ul.如果流速太慢（即每一滴超过100秒）并切液滴的体积太小（如小于25ul），这需重新装柱。
3．当贮藏缓冲液流完，沿着柱子内壁小心加入700ul column buffer 到柱顶部，并使其流出；
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