技术领域
本发明涉及一种排卵检测试纸，尤其是涉及一种排卵检测试纸条及检测方法。
背景技术
促黄体生成素（LH）是由腺垂体嗜碱粒细胞分泌的物质。在女性（LH）协同促卵泡激素（FSH）共同作用维持卵巢的月经周期，导致排卵与黄体形成。LH的产生受下丘脑促性腺释放激素的控制，同时受卵巢的正、负反馈调控。在月经周期LH的释放高峰与卵巢排卵有着密切关系，LH高峰一经出现，预示24-36小时卵巢排卵，因此可以在月经周期中监测血清LH峰值，以确定最佳受孕时间。该检测结果以毫国际单位/毫升（mIu/ml）表示。
富硒叶面肥LH为糖蛋白，分子量约3万，其蛋白部分由204个氨基酸构成α和β两个亚基，α亚基与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）和人绒毛膜促性腺激素相同，只有β亚基具有特异的结构，两者通过非共价键连接。
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目前检测促黄体生成素（LH）的方法有时间分辨免疫荧光法（专利申请号：200810043552.5），该方法采用长效荧光标记物如稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）标记，通过时间分辨非特异性荧光，但是该方法需要利用稀土金属，成本高，标记难度大。
专利申请号201210571305.9的专利是采用标记荧光素的方法来检测促黄体生成素，该试剂盒有效期短，稳定性差。
中国发明专利CN201310237681.9公开了一种促黄体生成素纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，该试剂盒使用方法复杂，需要用到化学发光仪，不适用于家庭监测。
胶体金法检测排卵试纸条成为家庭自检的主流，操作判读简单，无需样本稀释和仪器设备，但由于LH的a亚基与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）的α亚基结构相同，易造成交叉导致结果异常判读。
发明内容
本发明是为了解决现有技术的排卵检测试纸所存在的上述问题，提供了一种可监测吸烟代谢产物可替宁，其灵敏度与特异性均不受影响，灵敏度高，特异性好的排卵检测试纸条。 本发明还提供了一种排卵检测方法，步骤简单，测试结果准确。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种排卵检测试纸条，包括PVC底板、样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，所述硝酸纤维素膜、样本垫、金标垫及吸水垫均固定于PVC底板表面，硝酸纤维素膜的两端分别搭接吸水垫、金标垫，所述金标垫的外端搭接样本垫，硝酸纤维素膜上设有检测线T1、检测线T2及质控线，检测线T1上包被有鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4，检测线T2上包被有可替宁抗原，质控线上包被有羊抗鸡IgY多克隆抗体，金标垫上固化有胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物及胶体金-可替宁单克隆抗体结合物。本发明在现有胶体金法检测排卵试纸条基础上，使用了针对β-LH抗原两个特异性表位的单克隆抗体，避免了与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）交叉造成的异常判读结果，通过肉眼可见的检测线、质控线显强度对比，随时在家监测排卵期；本发明在现有的排卵检测试纸条基础上，在检测线T1和质控线之间还设置包被有吸烟代谢物可替宁抗原的检测线T2，并在金标垫上喷涂了胶体金标记的可替宁抗原的抗体。利用双抗夹心法检测人体尿液中的LH抗原。采用竞争抑制法，当尿液中没有吸烟代谢物可替宁时，标记的可替宁抗体和检测线T2包被的可替宁抗原结合反应，在检测线T2显。本发明在预测排卵的同时，可以检测是否有吸烟代谢物可替宁残留，从
而实现指导广大女性尤其主动吸烟和被动吸烟女性健康备孕，优生优育的目的；检测线T1与检测线T2、检测线T2与质控线间的间距控制在0.3cm。
作为优选，所述样本垫和吸水垫上设有保护膜。
作为优选，所述金标垫通过以下方法制得：
（a）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na 2HPO 土压力盒4.12H 2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至7.5，取鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8，按5ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物，备用。
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（b）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na 2HPO 4.12H 2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取鸡IgY抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅
拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鸡IgY抗体结合物，备用。
（c）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na 2HPO 4纸张打孔机.12H 2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取可替宁单克隆抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min，10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-可替宁单克隆抗体结合物，备用。
（d） 将上述胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物和胶体金-可替宁单克隆抗体结合物按体积比5:1:2比例混合，用金标稀释液对该混合物按体积百分含量50%进行稀释，涡旋混匀后以喷量6ul/cm均匀喷涂在金标垫上，烘干。37℃烘干。
作为优选，所述金标保存液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa 2HPO 4.12H 2O，1g BSA，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M
盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml即为金标保存液。
作为优选，所述金标稀释液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa 2HPO 4.12H 2O，1g BSA，1g Tween-20，20g 蔗糖，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
作为优选，所述硝酸纤维素膜通过以下方法制得：将将硝酸纤维素膜平整贴在PVC底板中央位置，用包被缓冲液分别将鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4稀释至浓度为1.0mg/ml，可替宁抗原稀释至浓度为0.3mg/ml，羊抗鸡IgY多克隆抗体稀释至浓度为0.5mg/ml，将稀释好的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T1上，将稀释好的可替宁抗原溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T2上，将稀释好的羊抗鸡IgY多抗溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的质控线上，烘干。37℃烘干。
作为优选，所述包被缓冲液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa 2HPO 4.12H 2O，0.9g Nacl，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
作为优选，所述样本垫通过以下方法制得：将玻璃纤维裁成所需规格后，用样本垫处理液喷涂均匀，烘干；所述样本垫处理液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入3.58gNa 2HPO 4.12H 2O，0.5g BSA，1g S9，1g PVP，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。37℃烘干。
作为优选，所述鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4和鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8通过以下方法制得：
（一）制备β-LH重组抗原
（1）以人β-LH糖蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAstar分析其抗原序列，选取β-LH中特有的两个表位序列A和B，与FSH、TSH糖蛋白序列比较结果表明无同源性，为β-LH所特有，将A和B表位通过柔性片段（GlyGlyGlyGlySer）连接，得到如SEQ ID No：1所示的β-LH重组蛋白氨基酸序列。
（2）β-LH重组蛋白氨基酸序列不变前提下，根据CHO细胞偏爱密码子将β-LH重组蛋白氨基酸序列转化为对应的β-LH重组蛋白核苷酸序列，得到的β-LH重组蛋白核苷酸序列如SEQ
ID No：2所示，在β-LH重组蛋白核苷酸序列上下游分别添加酶切位点EcoRI和BamHI对应的核苷酸序列后合成目的基因，将目的基因克隆于pMD19-T载体。
（3）用限制性内切酶EcoRI和BamHI于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pTT5载体12h，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pTT5载体；使用T4连接酶将回收的目的基因和pTT5载体按7:1的比例于4℃连接12h后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，于37℃恒温培养12h后，于平板上挑取单克隆菌株至含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经EcoRI和BamHI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
（4）将构建好的重组表达载体转染CHO-K1细胞。根据转染体系每毫升中加入2.4μg重组表达载体和3.6μg转染试剂PEI，37℃，6% CO 2摇床转速120rpm培养6h，加入1% 200mMVPA以及1% 20g/L L-盐酸半胱氨酸，37℃，6% CO 2摇床转速120rpm培养7天后离心收集上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，20mM咪唑溶液去除杂蛋白，300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，收液后转至截留分子量为3kD-5kD的透析袋中，于10mmol/L、pH7.4的PBS
溶液中过夜透析；透析后取出于-20℃保存备用，即得β-LH重组抗原，其中20mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑0.136g，加10mmol/L、pH7.4 的PBS溶液溶解定容至100mL；所述300mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑2.04g，加10mmol/L、pH7.4的PBS溶液溶解定容至100mL。（二）制备鼠抗人β-LH单克隆抗体
（Ⅰ）取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100ug β-LH重组抗原，共400ul/只；25天后进行第二次加强免疫，具体方法为：取80ugBSA偶联蛋白用福氏不完全佐剂乳化，共400ul/只，皮下多点注射；20天后第三次加强免疫，第三次加强免疫方法同第二次加强免疫；20天后，处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，与生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，通过聚乙二醇使融合；再加入等体积饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板，于37℃、5％二氧化碳培养箱培养；5天后半保留换液，10天后采用酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞的上清；检测阳性的杂交瘤细胞，使用有限稀释法进行三次亚克隆，最终用β-LH重组蛋白经酶联免疫吸附法筛选得到2株单克隆细胞株1A4和6B8。
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