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杨秀梅;邢国杰;徐宽;沈鹤柏;朱龙章
【摘 要】采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析方法,建立对人绒毛膜促性腺激素的快速定量检测方法.该检测方法可以在15 min内完成对HCG的定量检测,灵敏度可达25 mIU/mL,线性范围25～10000 mIU/mL.与人促黄体生成素(hLH)、人促甲状腺激素(hTSH)、人卵泡刺激素均无交叉反应,所建立的检测人绒毛膜促性腺激素的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的人绒毛膜促性腺激素,在异位妊娠的早期诊断及过程监控中具有较为广阔的应用前景.%Colloidal gold was prepared through reducing reaction of gold ions by sodium citrate. The rapid detection method was established with double-antibody sandwich assay. A rapid and quantitative detection method for human chorionic gonadotrophin u-sing colloid gold immunochromatographic assay was developed,which could accomplish qualitative detection in 15 min. The sensitivity was up to 25 mlU /mL. HCG sample with concentration of 25 mIU /mL to 10000 mIU /mL was measured. There were no cross-reactions with other hormones,such as hLH, hTSH,Hfsh. The colloidal gold immunochromatographic assay is rapid, specific , sensitive, accurate and suitable for HCG, showing good potential in the early diagnosis of ectopic pregnancy and process monitoring.
【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2012(041)003
【总页数】蒸缸6页(P274-279)
【关键词】HCG;胶体金;免疫层析;定量检测
【作 者】杨秀梅;邢国杰;徐宽;沈鹤柏;朱龙章
【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234
【正文语种】中 文
【中图分类】O648
0 前 言
人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotropin,HCG)是由胎盘合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素[1].HCG的产生与滋养细胞的生长状况和数量有直接关系[2],正常发育的绒毛所分泌的HCG量很大,每天的滴度不断地快速上升,每48 h上升66%以上.如果HCG每2 d增加的量>66%,可以诊断为宫内妊娠;而如果增加的量<66%,则异位妊娠或宫内孕发育不良的可能性很大[3].HCG是妊娠时所分泌的特异性激素,可用于协助异位妊娠早期未破裂的诊断.目前较为明确的诊断方法为B超,但是在怀孕5周内B超难以发现胚芽的影像,所以寻早期诊断异位妊娠的方法显得尤为重要.因此,本文作者试图探讨血清人绒毛膜促性腺激素检测在异位妊娠早期诊断的价值 .
胶体金免疫层析方法对人绒毛膜促性腺激素的定量检测的研究目前只达到半定量的水平,而本研究则实现了对人绒毛膜促性腺激素的定量检测.这弥补了胶体金免疫层析方法中无法定量的缺陷,这在医学领域将会带来一个新的突破,极具现实意义与医用价值.
目前现有的胶体金免疫层析试条只能定性判断是否怀孕,而先兆流产、异位妊娠、药物引流、某些妇产科疾病、术后过程等都需要对HCG指标变化进行跟踪及对HCG进行定量检测[4-5].孕卵在子宫腔以外的任何部位着床发育,均称异位妊娠[6].异位妊娠是妇产科常见急腹症之一,当输卵管妊娠流产或破裂时可引起腹腔内严重出血,如不能及时就诊、处理可危及生命[7].HCG动态定量检测可作为异位妊娠随访监控指标,对早期异位妊娠的诊断具有重要意义[8].本研究在常规早孕试纸定性检测的基础上,对原有胶体金免疫层析技术进行改进,实现了HCG的定量检测,对异位妊娠的早期诊断及过程监控具有重要的影响.
1 材 料
1.1 主要材料
HCG单克隆抗体、羊抗鼠二抗(上海捷宁生物科技有限公司);硝酸纤维素膜、吸水纸、玻璃纤维购于美国Millipore公司;柠檬酸三钠(上海青析化工有限公司);氯金酸(国药集团化学试剂有限公司).
1.2 主要仪器
HM3010 单维往复划膜仪;AllegraTM64R 台式高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司);金标分析仪(中国科学院上海光学精密机械研究所) .
熏蒸床
2 试纸条的制备方法
2.1 胶体金的制备
用柠檬酸三钠还原法[9]制备20 nm胶体金.向洗净的锥形瓶中加入98 mL的超纯水,再加入1%的氯金酸2 mL.将锥形瓶放在恒温搅拌器上加热至沸腾,维持加热状态并加入1%柠檬酸三钠2 mL.继续煮沸10 min,观察颜变化,冷却至室温后置于4 ℃冰箱待用.
2.2 结合垫的制备
取1 mL的胶体金用0.1 mol/L的 K2CO3溶液调节pH值到8.0～9.0,加入36 μg α-HCG抗体,混匀涡旋并静置10 min,加入50 μL BSA(10%)溶液反应10 min后,用离心机在13000 r/min下离心15 min,弃去上清液,沉淀物用硼酸盐缓冲溶液重悬至原体积后,再次离心弃去上清液,浓缩至原体积的1/10,4 ℃保存.胶管缠绕机
选用玻璃纤维作为结合垫材料,将上述制备的胶体金α-HCG抗体复合物重新分散于0.01 mol/L PBS(pH=7.4,含5%蔗糖,1%BSA)中,并喷于结合垫上,37 ℃烘干2 h.
2.3 样品垫的制备
选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料,将其放入样品垫处理液(0.01 mol/L PBS(pH=7.4),含有1%BSA,0.1%Triton X-100)中浸泡后,37 ℃烘干2 h备用.
视频无线传输2.4 硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
用划膜仪在NC膜的不同位置喷点α-HCG单抗及羊抗鼠IgG抗体,自下至上依次为质控线(C线)、检测线(T线),37℃烘干2h备用.
2.5 试纸条的组装
将吸水纸、NC膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的PVC底板上,并切成4 mm宽的试纸条装壳.
3 实验结果
训练监控
3.1 胶体金的表征
3.1.1 胶体金的紫外扫描
对2.1.1所制备的20 nm的胶体金进行紫外扫描,测定结果见图1,从图1上可看出所制备的20 nm的胶体金的最大吸收峰位于520 nm处, 这与文献[10]报道的一致,符合实验的要求.
图1 20 nm胶体金的紫外—可见扫描曲线
3.1.2 用Zeta电位分析仪对所制得的胶体金进行Zeta电位、粒径测定
对所制备的20 nm胶体金进行Zeta电位、粒径的测定.测定结果见图2和图3.可以看出,所制备的胶体金的平均Zeta电位是-25.0 mV(图2),胶体金颗粒的平均粒径大约为20.01 nm(图3).
图2 胶体金的粒径分布曲线
图3 胶体金的Zeta电位扫描曲线
3.1.3 用透射电子显微镜(TEM)对胶体金进行扫描
对所制备的20 nm的胶体金用透射电子显微镜(TEM)对胶体金进行扫描,扫描结果见下图4,从图4中可以看出胶体金颗粒粒径在20 nm左右,而且粒径分布比较均一,形貌接近于球形,符合实验的要求.
图4 20 nm胶体金的透射电镜图
3.2 胶体金免疫层析试纸条的构造图
将吸水纸、NC膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的PVC底板上,并切成4 cm宽的试纸条,胶体金免疫层析试纸条的构造见图5.
图5 胶体金免疫层析试纸条构造图
3.3 检测结果的判读
3.3.1 定性检测
将待测样品滴加到检测卡的加样孔中,静置15 min,观察结果.质控线和检测线均出现红为阳性,仅质控线出现红为阴性,质控线不显为无效.
3.3.2 定量检测判定
将显后的试纸条放入金标分析仪中进行扫描,读取T/C比值,大于判定值为阳性[11].
3.3.3 定量检测重复性
检测6个浓度的HCG样品,每个浓度检测10次,并用金标分析仪扫描读取信号T/C值.每个浓度样品10次检测的T/C值的标准差与平均值的比值即为变异系数.
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