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生物实验室常用实验方法

1、总RNA的提取（Trizol法提取）

2、 PCR

3、琼脂糖核酸电泳

4、胶回收纯化DNA

5、大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

6、感受态细胞的制备

7、重组子的筛选和鉴定

8、转染细胞

总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；

3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，重组胶原蛋白12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）

离心5分钟，弃上清；

6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

PCR

实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液：

TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方

Reagent	Quantity, for 50µl of reaction mixture
10X PCR buffer （Mg2+ free）	5 µl
MgCl2（25mM）	如TaKaRa TaqTM加3 µl
MgCl2（25mM）	如TaKaRa EXTaqTM加4 µl
2.5mM dNTP mix	4 µl
10µM Primer 上游	1 µl
10µM Primer下游	1 µl
Template DNA	1 µl
Taq或EXTaqDNA Polymerase	0.25 µl
Sterile deionized water	Up to 50µl
Total	50 µl /Sample

PyrobestTM DNA Polymerase的配方

Reagent	Quantity, for 50µl of reaction mixture
10X Pyrobest buffer	5µl
2.5mM dNTP mix	4µl
10µM Primer上游	1µl
10µM Primer 下游	1µl
Template DNA	1µl
PyrobestTM DNA Polymerase	0.25µl
Sterile deionized water	Up to 50µ冲压滤网l
Total	50µl /Sample

1 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；

2 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；

3 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50µl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；

2. 按以下程序进行PCR扩增。

PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。

Step	Temperature, °C	Time, min	Number of cycles	Note
起始变性	94~95	1-3	1
变性	94~95	0.5-2	25-35	退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
退火	37-70	0.5-2		退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
延伸	70-75	根据扩增产物的大小		每分钟延伸1000bp
最终延伸	70-75	10	1

反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。

RT-PCR

Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)

1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液

苯乙烯树脂

Reagent	Quantity, for 50µl of reaction mixture
10×One Step RNA PCR Buffer	5µl
25 mM MgCl2	10µl
10 mM dNTP mix	5µl
RNase Inhibitor (40 U/µl)	1防辐射内衣µl
AMV-Optimized Taq	1µl
AMV RTase XL (5 U/µl)	1µl
上游特异Primer (20 µM)	1µl
下游特异Primer (20 µM)	1µl
实验样品RNA（≤1 µg Total RNA）	1µl
RNase Free dH2O	24µl
Total	50µl /Sample

1. 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；

2. 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的光立方制作PCR薄壁管中；

3. 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50µl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；

2．按以下条件进行反应

Step	Temperature, °C	Time, min	Number of cycles	Note
逆转录	50	30	1
逆转录酶失活	94	2	1
变性	94	0.5	25-35
退火	37-65	0.5		退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
延伸	72	根据扩增产物的大小		Taq酶每分钟延伸1000bp
最终延伸	72	10	1

反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。

琼脂糖核酸电泳

1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；

2. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；

3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；

4. 室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；

5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；

6. 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用将样品混合

液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；

7. 接通电源，红为正极，黑为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；

8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；

9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖凝胶浓度	线形DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5%	1,000～30,000
0.7%	800～12,000
1.0%	500～10,000
1.2%	400～7,000
1.5%	200～3,000
2.0%	50～2,000