导读
⾼通量测序技术⼜称“下⼀代”测序技术，以能⼀次并⾏对⼏⼗万到⼏百万条DNA分⼦进⾏序列测定和⼀般读长较短等为标志。因其⾼通量、不依赖于已知核酸序列和具有更⾼的灵敏度，从最初未知β属冠状病毒的快速鉴定到病毒序列的完整破译，再到病毒序列的变异监测，⾼通量测序技术在疫情防控⼯作中发挥了⾮常重要的作⽤。
欧阳能太
教授
现任中⼭⼤学孙逸仙纪念医院病理科副研究员，细胞分⼦诊断中⼼副主任
于中⼭医科⼤学取得医学本科和病理硕⼠学位，德国慕尼⿊科技⼤学取得医学博⼠学位，在纽约医学院和纽约州⽴⼤学完成博⼠后训练
曾分别任⼴州医学院附⼀院病理医师、Texas A&M University毒理与肿瘤实验室Scientist和纽约州⽴⼤学肿瘤预防研究所副教授
主要研究⽅向为肿瘤病理曾获多项美国NIH研究基⾦
发表SCI论⽂50多篇以及Elsevier和Springer出版社Book Chapter多篇
NGS实验室建设原则及注意事项
欧阳能太教授：NGS技术是精准医学领域中⼀项⾮常关键的技术。精准诊断离不开分⼦诊断，⽽NGS技术是其中最难亦是应⽤最⼴的⼀项分⼦诊断技术。NGS技术相对⽐较复杂，需要⼀整套的系统⼯程才能完成，其中NGS实验室的建设⾮常关键，也容易出现问题。
NGS实验室的建设原则可参考我们这⼀领域的⼤咖李⾦明教授提出的⼀个原则，其称之为“16字⽅针”，即各区独⽴、注意风向、因地制宜、⽅便⼯作。前两个原则涉及如何设置，后两个原则则提醒注意不要⾛过头，应根据医院的实际情况，注意⼯作的⽅便，不拘泥于标准。这也是我提醒⼤家需要特别注意的第⼀点。⽬前各个医院对NGS技术的⽀持⼒度很⼤，但在建设NGS实验室时需注意总体⾯积不宜过⼤，以免能耗消耗⾮常⼤。此外，在实验室各区⽐例的设置上不要求平均⽐例，有的环节很⼩即可，有的环节可相对较⼤⼀些，即⽐例要合适。随着医院对NGS实验室的⽀持⼒度越⼤，要求也越为严格，但有些医院也出现⾛极端的情况，即分区⾮常多，房间数很多，但实际并不⽅便⼯作。应注意类似步骤的合并，设置适当的房间数。
第⼆点，需注意风向。其⼀，NGS实验室应使⽤全新风系统，⽽不能使⽤普通家⽤空调。新风系统可排出污染，⽽这是防污染最基础的设置。其⼆，需注意整个房间的⽓流⽅向应形成对流才有效。其三，⽬前出现问题较⼤的是⽣物安全柜、通风柜和超净⼯作台这三种设备的合理配置使⽤。对于样本的处理，需使⽤⽣物安全柜。⽣物安全柜通常使⽤A2级，不要太⾼级，30%外排即可满⾜基本需求。B2级过⾼，100%外排，其实并不是很合适。超净⼯作台除了在试剂准备间中可以使⽤外，其他地⽅不适宜使⽤。在所有环节中均使⽤超净⼯作台是不对的，因为超净⼯作台没有外排功能，如果DNA⽓溶胶⼀直在室内循环是不合适的。⽽有的单位为了重视起见，所有环节，包括⽂库构建都使⽤⽣物安全柜，实际上也没有必要。除了样本处理间，其他地⽅使⽤通风柜即可。相关注意事项很多，在此不⼀⼀赘述。 NGS质量控制三⼤要点
欧阳能太教授：NGS技术是⼀项系统⼯程，质量控制⾮常重要，主要的质控点有三个。第⼀个便是肿瘤样本的质控。在实际⼯作中有时会出现搞错样本的情况，或是前期诊断的失误等。例如，对肺腺癌进⾏EGFR检测，但如果拿到的是⼩细胞肺癌的样本，则通常不做。其次，对样本中癌细胞的数量要进⾏质控。细胞数量太少，可能⽆法测出。虽说NGS灵敏度⽐较⾼，但仍有检测下限。⽽癌细胞占⽐也很重要，如果癌细胞占⽐很⼩，⽽其他细胞占⽐很⼤，也会影响检测灵敏度，此时需要进⾏富集。概⽽⾔之，即在肿瘤样本的质控上需注意肿瘤类型、癌细胞总体数量和占⽐。 第⼆个质控点是⽂库构建。⽂库构建是⼀个中间环节，即上机之前样本是否准备妥当。主要涉及浓度和⽚段⼤⼩是否符合要求。浓度，⼀般使⽤Qubit测浓度即可；⽚段⼤⼩，通常⽤Agilent 2100做质控。
合要求。浓度，⼀般使⽤Qubit测浓度即可；⽚段⼤⼩，通常⽤Agilent 2100做质控。
第三个质控点是数据，即测序后下机的数据是否符合要求。因为前两个步骤可能没有发现问题，但最后测序却不⾏。这其中涉及很多⽅⾯，包括测序仪本⾝运⾏是否正常等。数据质控是最后⼀个质控点，如果上述均⽆问题，则可进⾏后续的临床分析和解读。
NGS应⽤前景展望
欧阳能太教授：NGS技术⾮常强⼤，也是⼀项⾮常好的技术，其应⽤于临床也才刚刚起步，⽬前还有很多⼤医院都没有开展。我相信在未来NGS技术的应⽤不论是使⽤的范围，还是使⽤的深度都将有很⼤的发展。
⾼通量测序（NGS）实验室
⾼通量测序（NGS）实验室是什么？
⾼通量测序检测实验室也叫NGS实验室，是以⾼通量测序技术为检测⼿段，来完成临床疾病筛查、诊断或辅助诊断、肿瘤基因突变检测等项⽬。
由于NGS技术对所检测的核酸模板进⾏⼤量扩增，容易出现实验室污染导致检测结果不准确；且NGS实验要求⾼、影响因素多，实验过程处理不当也会导致检测结果异常。因此⼀个严格有序、规范的NGS实验室是⾮常必要的。
单向器
⾼通量测序（NGS）实验室
⽬前⾼通量测序技术在临床检测上的应⽤越来越⼴泛，今天给⼤家简单介绍⼀下NGS实验室的建设和合理分区。
⼀、什么是⾼通量测序（NGS）技术？
⾼通量测序技术⼜称NGS (Next Generation Sequencing) 技术，它是对传统Sanger测序技术（即⼀代测序技术）进⾏了⾰命性的升级，可同时对⼏⼗万到⼏百万条核酸分⼦进⾏序列测定，使得转录组学和基因组学被⼴泛应⽤于临床疾病诊疗实践中，预⽰着疾病诊疗分⼦时代的到来。
⼆、什么是⾼通量测序（NGS）实验室？
⾼通量测序检测实验室也叫NGS实验室，是以⾼通量测序技术为检测⼿段，来完成临床疾病筛查、诊断或辅助诊断、肿瘤基因突变检测等项⽬。⾼通量测序实验包括湿桌实验过程和⼲桌实验过程，其中湿桌实验是指实验标本预处理、核酸提取及其⽚段化、建库、扩增、靶序列富集、混样、测序前准备及测序，⼲桌实验是指测序后的数据分析、对⽐、注释和结果报告等⽣物信息学分析流程。
由于NGS技术对所检测的核酸模板进⾏⼤量扩增，容易出现实验室污染导致检测结果不准确；且NGS实验要求⾼、影响因素多，实验过程处理不当也会导致检测结果异常。因此⼀个严格有序、规范的NGS实验室是⾮常必要的。
三、 NGS实验室设计原则有哪些？
1、各区独⽴
实验室各个区域⽆论是在物理空间上还是实际使⽤过程中，都应当处于完全分隔状态，并且各区域之间不能有空⽓的直接流通。 2、单⼀流向
NGS检测通常涉及PCR扩增及核酸纯化富集等过程，任何样本源性污染、分析标签源性污染、扩增产物污染或⽓溶胶污染均可能导致假阳性或假阴性结果出现，因此各实验区域与缓冲间应有⼀定的通风
压⼒差，保证合理的空⽓流向，防
污染均可能导致假阳性或假阴性结果出现，因此各实验区域与缓冲间应有⼀定的通风压⼒差，保证合理的空⽓流向，防⽌污染。
3、因地制宜
新建实验室除合理规范外，也要易于管理；若原有实验室通过合理的规划改造也能满⾜质量管理要求，亦可不必特地新建实验室。
4、⽅便⼯作
实验室区域选择及空间设计还应最⼤限度考虑是否⽅便⽇常监测⼯作，包括⽅便⼈员流动效率、⼤型仪器设备进出落地等。
四、 NGS实验室如何分区？
NGS实验室分区⽰意图
（引⾃李⾦明. ⾼通量测序技术）
1、试剂准备区
多功能制水机本区域为洁净区域，⽤于试剂的配制、分装及少量储藏等，需存放于此区域的试剂不可逆⾏由后续处理样本的区域进⼊。另外，试剂盒中的阳性质控品和对照品不应贮存于此区域。
仪器设备：冰箱、⽣物安全柜、纯⽔仪、涡旋振荡器、移液器和离⼼机。
2、样本准备区
本区域为半污染区，⽤于核酸的提取及浓度测定。在提取不同类型的样本（新鲜组织、FFPE、⾎液等）核酸时应避免样本之间的交叉污染，建议在区域内设置不同样本的独⽴的超净⼯作台。布局时应注意⾼速离⼼机运⾏时产⽣的振动是否⼲扰其它设备等细节。
仪器设备：冰箱、⽣物安全柜、核酸⾃动提取仪、⾼速离⼼机、⽔浴锅、恒温⾦属浴、核酸定量仪、冰箱、移液器、涡旋振荡器和磁⼒架。
3、⽂库制备区
本区域为半污染区，⽤于⽂库的构建。NGS检测时常见的⽂库制备⽅法有杂交捕获法和扩增⼦法，两种⽅法均包含通过PCR放⼤⽂库产量的步骤，因此在⽂库制备区构建⽂库时，建议⽂库扩增产物传递
卷帘门锁
⾄下⼀阶段区域（杂交捕获区）进⾏纯化及后续操作。另外，组织样本进⾏捕获法建库时需要先对样本做⽚段化处理，因此操作台⾯规划时应区分⽚段化区域和建库区域。
仪器设备：冰箱、⽣物安全柜、普通PCR仪、核酸定量仪、磁⼒架、超声打断仪、移液器、涡旋振荡器和离⼼机。4、杂交捕获区
本区域为半污染区，⽤于⽂库扩增后的纯化，以及后续的⼆次扩增或捕获富集等步骤。严防此区域扩增产物及⽓溶胶等对其它区域的污染，尽量减少⼈员在该区域与其它区域之间反复频繁流动，同时该区域的实验物品、实验服等尽量避免外带。
仪器设备：普通PCR仪、核酸定量仪、磁⼒架、⾦属浴、真空浓缩仪、移液器、涡旋振荡器和微型离⼼机。
5、⽂库扩增区
本区域为半污染区，对杂交捕获产物进⾏PCR扩增富集，同时对上机测序前的⽂库进⾏质控，并且完成⽂库上机前⽂库最终的稀释和混样。
仪器设备：冰箱、普通PCR仪、核酸定量仪、磁⼒架、移液器、涡旋振荡器和微型离⼼机。
6、测序分析区
金属工艺品制作本区域为半污染区，⽤于⽂库的上机测序。此区域应配备稳定的供电设施及备⽤电源，并配备独⽴的制冷设施保证测序仪在相对恒定的温湿度环境下⼯作；还需开设适宜⾯积的机房⽤于放置服务器等，所配备的⽹关设备应兼具稳定性和安全性，确保数据有效、安全传输。
仪器设备：测序仪、服务器、稳定电源。
7、电泳区
本区域为半污染区，⽤于核酸样本质量和⽂库⽚段的分析。
导尿管原理
仪器设备：冰箱、凝胶电泳、⽣物⽚段分析仪、移液器、涡旋振荡器和微型离⼼机。
总之，⼀个规范的NGS检测实验室是获得准确检测结果的重要保障，在实验室运⾏过程中要始终坚持 “⼯作有序、互不⼲扰、防⽌污染、报告及时”的基本准则。
参考⽂献：
马铃薯馒头[1] 李⾦明. ⾼通量测序技术[M]. 第1版. 北京: 科学出版社,2018.
⼩编后记：现在市场上分⼦⽣物学实验室设计、施⼯单位良莠不齐，很多设计施⼯单位并不专业，存在这样那样的问题。
为了在实验室建设中少⾛弯路，我们作为实验室的使⽤⽅，应该了解⼀下分⼦⽣物学实验室建设标准：
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