一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法与流程

1.本发明涉及生物肽技术领域，具体为一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法。

背景技术：

2.随着经济的发展和社会的进步，人类生活质量不断的提高，人们对自身身体健康有着更高的要求，预防疾病、减缓衰老、延长寿命是现代人共同追求的目标。随着生活质量的提高，饮食结构发生了巨大变化，一些慢性病也困扰着越来越多的人，例如心脑血管疾病。心脑血管疾病是心脏血管脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液粘稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病，具有高患病率、高致残率、高死亡率、多并发症的特点，即使应用目前最先进、完善的手段，仍达不到完全的治愈。
3.固定化酶是通过物理的或化学的方法，将酶分子束缚在载体上，在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等优点。现有的固定化方法有吸附法、包埋法、交联法、共价结合法等，但真正投入工业化应用的并不多，主要原因是固定化使用的载体材料成本高，其次是易破坏酶分子结构、固定量有限、多次使用后酶活性大幅度下降等。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，以解决现有技术中存在的问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，包括以下提取步骤：
6.(1)将蜂蜜溶于蜂蜜质量2～4倍的三水溶液中，-22～-18℃下保存30～40min后，5000～5200r/min、3～6℃离心3～12min后，取沉淀物，洗涤2～4次，置于蜂蜜质量0.1～0.3倍的超纯水中，-22～-18℃冷冻10～17h，得蜂蜜蛋白；
7.(2)将蜂蜜蛋白置于蜂蜜蛋白质量20～30倍的蒸馏水，搅拌混匀后，加入氢氧化钠至溶液ph为7.0～7.5，再加入蜂蜜蛋白质量0.1～0.5倍的固定化酶填料，进行第一次脉冲电处理，得蜂蜜多肽；
8.(3)将蜂蜜多肽进行第二次脉冲电处理，得具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽。
9.进一步的，步骤(1)所述蜂蜜为椴树蜂蜜、龙眼蜜或土蜂蜜的一种或多种混合。
10.进一步的，步骤(1)所述三水溶液为三和去离子水按质量1:4混合。
11.进一步的，步骤(1)所述洗涤的步骤为：将沉淀物置于蜂蜜质量0.9～1.2倍的超纯水，25～35khz处理3～10min后，5000～5200r/min离心3～12min。
12.进一步的，步骤(2)所述固定化酶填料的制备方法为：
13.a、将预处理氧化石墨烯、蒸馏水、三氯化铁、硫酸亚铁按质量比1:360:1.9:1.0～
1:410:2.5:1.5混合，搅拌溶解后，升温至55～67℃，按质量比1:0.1:0.1～1:0.3:0.2加入柠檬酸钠、尿素、三水硝酸铜，柠檬酸钠和预处理氧化石墨烯的质量比为4.5:1～5.6:1，搅拌均匀后，氮气氛围下，加入预处理氧化石墨烯质量30～38倍的质量分数为22％的氨水，升温至62～74℃，加热2～5h，继续升温至180～200℃，加热2～5h后，冷却至室温，用磁铁分离，用蒸馏水洗涤3～5次，60～70℃干燥8～12h，得磁性填料；
14.b、将酸化磁性填料、胰蛋白酶、乙酸水溶液按质量比0.5:1:968～2.0:1:990混合，乙酸水溶液中乙酸和去离子水的质量比为1:320～1:332，搅拌均匀后，加入胰蛋白酶质量128～135倍的tris缓冲液，40～50℃下反应30～42min后，用磁铁吸附分离，用去离子水清洗6～8次，室温干燥10～16h，得固定化酶填料。
15.进一步的，步骤a所述预处理氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨烯、质量分数为70％的硫酸、质量分数为68％的硝酸按质量比1:270:65～1:276:70混合，25～35khz下超声28～40min，60～70℃、40～60rpm搅拌12～19h后，加入去离子水至溶液ph为6～7，静置22～26h，过滤，用去离子水洗涤6～8次，将产物收集，70～80℃烘干9～14h。
16.进一步的，步骤b所述酸化磁性填料的制备方法为：将磁性填料、去离子水、、氢氧化钠按质量比1:450:3:4～1:500:6:8混合，25～35khz超声40～60min后，100～130rpm搅拌20～24h，抽滤，用去离子水冲洗6～10min，得酸化磁性填料。
17.进一步的，步骤(2)所述第一次脉冲电处理具体步骤为：30～40℃、电压为10～50v、脉冲频率1～5khz、占空比0.1～0.9下酶解9～14h后，用磁铁回收，2～6℃、10000～12000r/min离心3～12min，取上清液。
18.进一步的，步骤(3)所述第二次脉冲电处理具体步骤为：将蜂蜜肽、烟酸铬、亚硒酸钠、去离子水按质量比1:15:0.2:0.2～1:20:0.5:0.5混合，加入氢氧化钠至溶液ph为8～9，50～60℃、10～20kv/cm、1200～1500hz下反应50～62min后，冷却至室温，加入蜂蜜肽质量10～16倍的无水乙醇，静置15～19h后，5000～5500r/min离心2～12min，-20～-18℃冷冻10～13h。
19.进一步的，权利要求1～9任一项所述的具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽提取物应用于制备具有改善心脑血管疾病的药物、保健食品中。
20.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
21.本发明采用固定化酶填料提取出蜂蜜多肽，并螯合铬硒，具有抗氧化性，可有效改善心脑血管疾病，具有无痛苦、疗效显著、无副作用的特点，并且固定化酶填料能够多次回收利用，节约成本。
22.首先，蜂蜜肽具有抗氧化作用，可以延缓血管硬化，能够改善心脑血管疾病，因此本发明以蜂蜜为原材料，在三的作用下，提取出蜂蜜蛋白，然后采用固定化酶填料，进行第一次脉冲电处理，快速运动、分离，加快酶解反应，提取出多肽；然后进行第二次脉冲电处理，与铬、硒螯合，由于硒有促进损伤心脑血管的修复和再生作用，在维持心脑血管结构及功能方面起着非常重要的作用，铬能显著改善高血脂症的脂质代谢，因此能够有效改善心脑血管疾病。
23.其次，先将氧化石墨烯进行第一次酸化处理，使表面携有羧基，能够吸附铁离子，不断沉积生长，从而将磁性四氧化三铁引入氧化石墨烯层间，使固定化酶填料具有磁性，可以回收利用，极大节约工业成本；此外，四氧化三铁的插层反应，使氧化石墨烯的片层扩大，
形成扩散通道，使胰蛋白酶更易进入片层内，能更好地固定酶，增益固定化酶填料的回收利用效果；并且在四氧化铁成核生长过程中，在柠檬酸钠的作用下，螯合铜，形成三维复合结构，提高固定化酶填料的导电性，在酶解过程中，配合脉冲电场，可提高酶活性，有利于酶促反应的进行，并且，铜可与酶分子的活性部位结合，提高酶活力，从而使固定化酶填料多次回收利用后，仍能保持酶活性；然后进行第二次酸化处理，使固定化酶填料富含羟基基团，与酶分子发生氢键作用，加强载体与酶分子的作用力，可以固定更多的酶分子，提升酶活性，增益固定化酶填料的可回收利用效果。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.为了更清楚的说明本发明提供的方法通过以下实施例进行详细说明，在以下实施例中制作的具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽以及固定化酶填料的各指标测试方法如下：
26.可回收利用效果：取实施例与对比例相同质量的固定化酶填料进行相对活力测试，在固定化酶中加入1.0ml酶激活剂(0.1mol/l的pbs溶液中含0.05mol/l半胱氨酸和0.01mol/l的edta)，40℃预热10min，再加入1.0ml40℃经预热的2％酪蛋白溶液，40℃精确反应10min，立即加入10％三2ml，摇匀静置10min后过滤，取滤液1.0ml加5.0ml0.4mol/l碳酸钠溶液及1.0ml福林2酚试剂40℃显20min，测定od660；再投入提取使用7次后，再次测量相对活力；相对活力＝固定化酶活力/(加入酶总活力-残留酶总活力)
×
100％。
27.改善心脑血管效果：取相同质量的实施例与对比例进行血脂、血压效果测试；
28.血脂：选体重为18～22g的小白鼠分组，每组雌雄10只；选取一组为对照组，提供正常丸剂饲料；选取一组为高血脂模型组，提供高脂质饲料；实施例与对比例在提供高血脂饮食时，同时分别灌胃给予提取得到的多肽；分组笼养，自由摄食饮水。每天一次，连续30天，于末次给药后次日，空腹采血，测定血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白；
29.血压：招募高血压患者，患者的收缩压平均值为165mm汞柱，将患者均分组，每组100名；分别试用本发明实施例和对比例提取得到的多肽，试用一个月后的收缩压进行测量(测三次取平均值)并记录下降值。
30.实施例1
31.(1)将椴树蜂蜜溶于椴树蜂蜜质量2倍的三水溶液，三水溶液中三和去离子水的质量为1:4，-22℃下保存30min后，5000r/min、3℃离心3min后，取沉淀物，将沉淀物置于椴树蜂蜜质量0.9倍的超纯水，25khz处理3min后，5000r/min离心3min，重复上述洗涤步骤2次，置于椴树蜂蜜质量0.1倍的超纯水中，-22℃冷冻10h，得蜂蜜蛋白；
32.(2)将氧化石墨烯、质量分数为70％的硫酸、质量分数为68％的硝酸按质量比1:270:65混合，25khz下超声28min，60℃、40rpm搅拌12h后，加入去离子水至溶液ph为6，静置22h，过滤，用去离子水洗涤6次，将产物收集，70℃烘干9h，得预处理氧化石墨烯；将预处理
氧化石墨烯、蒸馏水、三氯化铁、硫酸亚铁按质量比1:360:1.9:1.0混合，搅拌溶解后，升温至55℃，按质量比1:0.1:0.1加入柠檬酸钠、尿素、三水硝酸铜，柠檬酸钠和预处理氧化石墨烯的质量比为4.5:1，搅拌均匀后，氮气氛围下，加入预处理氧化石墨烯质量30倍的质量分数为22％的氨水，升温至62℃，加热2h，继续升温至180℃，加热2h后，冷却至室温，用磁铁分离，用蒸馏水洗涤3次，60℃干燥8h，得磁性填料；
33.(3)将磁性填料、去离子水、、氢氧化钠按质量比1:450:3:4混合，25khz超声40min后，100rpm搅拌20h，抽滤，用去离子水冲洗6min，得酸化磁性填料；将酸化磁性填料、胰蛋白酶、乙酸水溶液按质量比0.5:1:968混合，乙酸水溶液中乙酸和去离子水的质量比为1:320，搅拌均匀后，加入胰蛋白酶质量128倍的tris缓冲液，40℃下反应30min后，用磁铁吸附分离，用去离子水清洗6次，室温干燥10h，得固定化酶填料；
34.(4)将蜂蜜蛋白置于蜂蜜蛋白质量20倍的蒸馏水，搅拌混匀后，加入氢氧化钠至溶液ph为7，再加入蜂蜜蛋白质量0.1倍的固定化酶填料，30℃、电压为10v、脉冲频率1khz、占空比0.1下酶解9h后，用磁铁回收，2℃、10000r/min离心3min，取上清液，得蜂蜜多肽；
35.(5)将蜂蜜肽、烟酸铬、亚硒酸钠、去离子水按质量比1:15:0.2:0.2混合，加入氢氧化钠至溶液ph为8，50℃、10kv/cm、1200hz下反应50min后，冷却至室温，加入蜂蜜肽质量10倍的无水乙醇，静置15h后，50000r/min离心2min，-20℃冷冻10h，得具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽。
36.实施例2
37.(1)将龙眼蜜溶于龙眼蜜质量3倍的三水溶液，三水溶液中三和去离子水的质量为1:4，-20℃下保存35min后，5100r/min、4℃离心7min后，取沉淀物，将沉淀物置于龙眼蜜质量1倍的超纯水，30khz处理6min后，5100r/min离心7min，重复上述洗涤步骤3次，置于龙眼蜜质量0.2倍的超纯水中，-20℃冷冻13.5h，得蜂蜜蛋白；
38.(2)将氧化石墨烯、质量分数为70％的硫酸、质量分数为68％的硝酸按质量比1:273:67.5混合，30khz下超声34min，65℃、50rpm搅拌15.5h后，加入去离子水至溶液ph为6.5，静置24h，过滤，用去离子水洗涤7次，将产物收集，75℃烘干11.5h，得预处理氧化石墨烯；将预处理氧化石墨烯、蒸馏水、三氯化铁、硫酸亚铁按质量比1:385:2.2:1.25混合，搅拌溶解后，升温至61℃，按质量比1:0.2:0.15加入柠檬酸钠、尿素、三水硝酸铜，柠檬酸钠和预处理氧化石墨烯的质量比为5.05:1，搅拌均匀后，氮气氛围下，加入预处理氧化石墨烯质量34倍的质量分数为22％的氨水，升温至68℃，加热3.5h，继续升温至190℃，加热3.5h后，冷却至室温，用磁铁分离，用蒸馏水洗涤4次，65℃干燥10h，得磁性填料；
39.(3)将磁性填料、去离子水、、氢氧化钠按质量比1:475:4.5:6混合，30khz超声50min后，115rpm搅拌22h，抽滤，用去离子水冲洗8min，得酸化磁性填料；将酸化磁性填料、胰蛋白酶、乙酸水溶液按质量比1.25:1:979混合，乙酸水溶液中乙酸和去离子水的质量比为1:326，搅拌均匀后，加入胰蛋白酶质量131倍的tris缓冲液，45℃下反应36min后，用磁铁吸附分离，用去离子水清洗7次，室温干燥13h，得固定化酶填料；
40.(4)将蜂蜜蛋白置于蜂蜜蛋白质量25倍的蒸馏水，搅拌混匀后，加入氢氧化钠至溶液ph为7.3，再加入蜂蜜蛋白质量0.3倍的固定化酶填料，35℃、电压为30v、脉冲频率3khz、占空比0.5下酶解11.5h后，用磁铁回收，4℃、110000r/min离心7min，取上清液，得蜂蜜多肽；
41.(5)将蜂蜜肽、烟酸铬、亚硒酸钠、去离子水按质量比1:18:0.3:0.4混合，加入氢氧化钠至溶液ph为8.5，55℃、15kv/cm、1350hz下反应56min后，冷却至室温，加入蜂蜜肽质量13倍的无水乙醇，静置17h后，5250r/min离心7min，-19℃冷冻11.5h，得具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽。
42.实施例3
43.(1)将土蜂蜜溶于土蜂蜜质量4倍的三水溶液，三水溶液中三和去离子水的质量为1:4，-18℃下保存40min后，5200r/min、6℃离心12min后，取沉淀物，将沉淀物置于土蜂蜜质量1.2倍的超纯水，35khz处理10min后，5200r/min离心12min，重复上述洗涤步骤4次，置于土蜂蜜质量0.3倍的超纯水中，-18℃冷冻17h，得蜂蜜蛋白；
44.(2)将氧化石墨烯、质量分数为70％的硫酸、质量分数为68％的硝酸按质量比1:276:70混合，35khz下超声40min，70℃、60rpm搅拌19h后，加入去离子水至溶液ph为7，静置26h，过滤，用去离子水洗涤8次，将产物收集，80℃烘干14h，得预处理氧化石墨烯；将预处理氧化石墨烯、蒸馏水、三氯化铁、硫酸亚铁按质量比1:410:2.5:1.5混合，搅拌溶解后，升温至67℃，按质量比1:0.3:0.2加入柠檬酸钠、尿素、三水硝酸铜，柠檬酸钠和预处理氧化石墨烯的质量比为5.6:1，搅拌均匀后，氮气氛围下，加入预处理氧化石墨烯质量38倍的质量分数为22％的氨水，升温至74℃，加热5h，继续升温至200℃，加热5h后，冷却至室温，用磁铁分离，用蒸馏水洗涤5次，70℃干燥12h，得磁性填料；
45.(3)将磁性填料、去离子水、、氢氧化钠按质量比1:500:6:8混合，35khz超声60min后，130rpm搅拌24h，抽滤，用去离子水冲洗10min，得酸化磁性填料；将酸化磁性填料、胰蛋白酶、乙酸水溶液按质量比2:1:990混合，乙酸水溶液中乙酸和去离子水的质量比为1:332，搅拌均匀后，加入胰蛋白酶质量135倍的tris缓冲液，50℃下反应42min后，用磁铁吸附分离，用去离子水清洗8次，室温干燥16h，得固定化酶填料；
46.(4)将蜂蜜蛋白置于蜂蜜蛋白质量30倍的蒸馏水，搅拌混匀后，加入氢氧化钠至溶液ph为7.5，再加入蜂蜜蛋白质量0.5倍的固定化酶填料，40℃、电压为50v、脉冲频率5khz、占空比0.9下酶解14h后，用磁铁回收，6℃、12000r/min离心12min，取上清液，得蜂蜜多肽；
47.(5)将蜂蜜肽、烟酸铬、亚硒酸钠、去离子水按质量比1:20:0.5:0.5混合，加入氢氧化钠至溶液ph为9，60℃、20kv/cm、1500hz下反应62min后，冷却至室温，加入蜂蜜肽质量16倍的无水乙醇，静置19h后，5500r/min离心12min，-18℃冷冻13h，得具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽。
48.对比例1
49.对比例1与实施例2的区别在于步骤(5)的不同，将步骤(5)改为：将蜂蜜肽、烟酸铬、去离子水按质量比1:18:0.3:0.4混合，加入氢氧化钠至溶液ph为8.5，55℃、15kv/cm、1350hz下反应56min后，冷却至室温，加入蜂蜜肽质量13倍的无水乙醇，静置17h后，5250r/min离心7min，-19℃冷冻11.5h，得具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽。其余步骤同实施例2。
50.对比例2
51.对比例2与实施例2的区别在于无步骤(5)，其余步骤同实施例2。
52.对比例3
53.对比例3与实施例2的区别在于步骤(2)的不同，将步骤(2)改为：将氧化石墨烯置于容器中，升温至61℃，按质量比1:0.2:0.15加入柠檬酸钠、尿素、三水硝酸铜，柠檬酸钠和
氧化石墨烯的质量比为5.05:1，搅拌均匀后，氮气氛围下，加入氧化石墨烯质量34倍的质量分数为22％的氨水，升温至68℃，加热3.5h，继续升温至190℃，加热3.5h后，冷却至室温，过滤，用蒸馏水洗涤4次，65℃干燥10h，得磁性填料。其余步骤同实施例2。
54.对比例4
55.对比例4与实施例2的区别在于步骤(2)的不同，将步骤(2)改为：将氧化石墨烯、质量分数为70％的硫酸、质量分数为68％的硝酸按质量比1:273:67.5混合，30khz下超声34min，65℃、50rpm搅拌15.5h后，加入去离子水至溶液ph为6.5，静置24h，过滤，用去离子水洗涤7次，将产物收集，75℃烘干11.5h，得预处理氧化石墨烯；将预处理氧化石墨烯、蒸馏水、三氯化铁、硫酸亚铁按质量比1:385:2.2:1.25混合，升温至68℃，加热3.5h，冷却至室温，用磁铁分离，用蒸馏水洗涤4次，65℃干燥10h，得磁性填料。其余步骤同实施例2。
56.对比例5
57.对比例5与实施例2的区别在于步骤(3)的不同，将步骤(3)改为：将磁性填料、胰蛋白酶、乙酸水溶液按质量比1.25:1:979混合，乙酸水溶液中乙酸和去离子水的质量比为1:326，搅拌均匀后，加入胰蛋白酶质量131倍的tris缓冲液，45℃下反应36min后，用磁铁吸附分离，用去离子水清洗7次，室温干燥13h，得固定化酶填料。其余步骤同实施例2。
58.效果例
59.下表1、表2分别给出了采用本发明实施例1至3与对比例1至5的具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽以及固定化酶填料的性能分析结果。
60.表1固定化酶填料对酶的影响以及蜂蜜肽对高血压患者的调节功效
[0061][0062][0063]
表2蜂蜜肽对高血脂症小白鼠血脂水平的影响
[0064][0065][0066]
从实施例与对比例的使用前后相对酶活力实验数据对比可发现，本发明将酸化后的氧化石墨烯吸附铁离子，从而将磁性四氧化三铁引入氧化石墨烯层间，使氧化石墨烯的片层扩大，形成扩散通道，使胰蛋白酶更易进入片层内，能更好地固定酶，提高酶活性，增益固定化酶填料的回收利用效果；并且在四氧化铁成核生长过程中，螯合铜，形成三维复合结构，铜可与酶分子的活性部位结合，提高酶活力，从而使固定化酶填料多次回收利用后，仍能保持酶活性；然后进行第二次酸化处理，使固定化酶填料富含羟基基团，与酶分子发生氢键作用，加强载体与酶分子的作用力，可以固定更多的酶分子，提升酶活性，增益固定化酶填料的可回收利用效果；从实施例与对比例的收缩压平均下降值、血脂实验数据对比可发现，蜂蜜肽具有抗氧化作用，可以延缓血管硬化，能够改善心脑血管疾病，与铬、硒螯合，由于硒有促进损伤心脑血管的修复和再生作用，在维持心脑血管结构及功能方面起着非常重要的作用，铬能显著改善高血脂症的脂质代谢，因此能够有效改善心脑血管疾病。
[0067]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：

1.一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，包括以下提取步骤：(1)将蜂蜜溶于蜂蜜质量2～4倍的三水溶液中，-22～-18℃下保存30～40min后，5000～5200r/min、3～6℃离心3～12min后，取沉淀物，洗涤2～4次，置于蜂蜜质量0.1～0.3倍的超纯水中，-22～-18℃冷冻10～17h，得蜂蜜蛋白；(2)将蜂蜜蛋白置于蜂蜜蛋白质量20～30倍的蒸馏水，搅拌混匀后，加入氢氧化钠至溶液ph为7.0～7.5，再加入蜂蜜蛋白质量0.1～0.5倍的固定化酶填料，进行第一次脉冲电处理，得蜂蜜多肽；(3)将蜂蜜多肽进行第二次脉冲电处理，得具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽。2.根据权利要求1所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述蜂蜜为椴树蜂蜜、龙眼蜜或土蜂蜜的一种或多种混合。3.根据权利要求1所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述三水溶液为三和去离子水按质量1:4混合。4.根据权利要求1所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述洗涤的步骤为：将沉淀物置于蜂蜜质量0.9～1.2倍的超纯水，25～35khz处理3～10min后，5000～5200r/min离心3～12min。5.根据权利要求1所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述固定化酶填料的制备方法为：a、将预处理氧化石墨烯、蒸馏水、三氯化铁、硫酸亚铁按质量比1:360:1.9:1.0～1:410:2.5:1.5混合，搅拌溶解后，升温至55～67℃，按质量比1:0.1:0.1～1:0.3:0.2加入柠檬酸钠、尿素、三水硝酸铜，柠檬酸钠和预处理氧化石墨烯的质量比为4.5:1～5.6:1，搅拌均匀后，氮气氛围下，加入预处理氧化石墨烯质量30～38倍的质量分数为22％的氨水，升温至62～74℃，加热2～5h，继续升温至180～200℃，加热2～5h后，冷却至室温，用磁铁分离，用蒸馏水洗涤3～5次，60～70℃干燥8～12h，得磁性填料；b、将酸化磁性填料、胰蛋白酶、乙酸水溶液按质量比0.5:1:968～2.0:1:990混合，乙酸水溶液中乙酸和去离子水的质量比为1:320～1:332，搅拌均匀后，加入胰蛋白酶质量128～135倍的tris缓冲液，40～50℃下反应30～42min后，用磁铁吸附分离，用去离子水清洗6～8次，室温干燥10～16h，得固定化酶填料。6.根据权利要求5所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤a所述预处理氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨烯、质量分数为70％的硫酸、质量分数为68％的硝酸按质量比1:270:65～1:276:70混合，25～35khz下超声28～40min，60～70℃、40～60rpm搅拌12～19h后，加入去离子水至溶液ph为6～7，静置22～26h，过滤，用去离子水洗涤6～8次，将产物收集，70～80℃烘干9～14h。7.根据权利要求5所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤b所述酸化磁性填料的制备方法为：将磁性填料、去离子水、、氢氧化钠按质量比1:450:3:4～1:500:6:8混合，25～35khz超声40～60min后，100～130rpm搅拌20～24h，抽滤，用去离子水冲洗6～10min，得酸化磁性填料。8.根据权利要求1所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述第一次脉冲电处理具体步骤为：30～40℃、电压为10～50v、脉冲频率1～5khz、占空比0.1～0.9下酶解9～14h后，用磁铁回收，2～6℃、10000～12000r/min离心3～
12min，取上清液。9.根据权利要求1所述的一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述第二次脉冲电处理具体步骤为：将蜂蜜肽、烟酸铬、亚硒酸钠、去离子水按质量比1:15:0.2:0.2～1:20:0.5:0.5混合，加入氢氧化钠至溶液ph为8～9，50～60℃、10～20kv/cm、1200～1500hz下反应50～62min后，冷却至室温，加入蜂蜜肽质量10～16倍的无水乙醇，静置15～19h后，5000～5500r/min离心2～12min，-20～-18℃冷冻10～13h。10.权利要求1～9任一项所述的具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽提取物应用于制备药物、保健食品中。

技术总结

本发明公开了一种具有改善心脑血管疾病的蜂蜜肽的提取方法，涉及生物肽技术领域。本发明先氧化石墨烯进行第一次酸化处理，然后吸附铁离子、铜离子，沉积生长，插层于氧化石墨烯之中，形成三维复合结构，然后进行第二次酸化处理，提高酶固定量，有利于提高酶活性，增益固定化酶填料的重复利用性能；以蜂蜜为原材料，在三的作用下，提取出蜂蜜蛋白，然后采用固定化酶填料，进行第一次脉冲电处理，提取出多肽；然后进行第二次脉冲电处理，与铬、硒螯合，能够有效改善心脑血管疾病。本发明提取的蜂蜜肽具有改善心脑血管疾病的效果，且制备的固定化酶填料能够多次重复利用。固定化酶填料能够多次重复利用。