一目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（一）仪器1）台式高速离心机2）恒温水浴箱3）式移液器4）灭菌的EP管和Tip头（二）试剂 50mmol/LTri-Hcl，pH8.050mmol/LEDTA，pH8.0500ug/ml溶菌酶（现用现配）100ug/mlRNae
2)溶液Ⅱ：100mmol/LTri-Hcl，pH8.01%SDS400ug/ml蛋白酶K3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/LNaAc(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇7）70%乙醇
8)TE缓冲液：10mmol/LTri-Hcl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0(三)实验步骤
1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。
4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。
废钯碳回收钯技术
5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。
6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。
7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。 8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
植物DNA的SDS提取法：（一）试验试剂：
1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。
2）10SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4）0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。
5）Rnae溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnae）。6）氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8)SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9)1mol／LHCl。10)0.2mol/LNaOH。
11)二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12)1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13)0.05mol/LNaOH。
14)DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。（二）实验步骤：
1)称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。
2)将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。无边界网络
3)离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4)将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。
5)再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（40
00rpm）5min，取上清液置小烧杯中。的制备
6)用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7)然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9)加入已处理的Rnae溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。
10)加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnae蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11)再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。
微波功率放大器二、PCR扩增目的基因
(一)器材1)微量移液器
彩钢板屋顶2)灭菌的Tip头、PCR管3)PCR扩增仪
水溶性聚氨酯4)目的DNA（DNA模板）5)dNTP混合物6)引物对7)Tap酶
8)PCR扩增试剂盒（二）试剂
1）10某PCR缓冲液（含Tri-HCl100mmol/L;MgCl215mmol/L、KCl500mmol/L,pH8.3，0.1%明胶）
2)脱氧核苷三磷酸dNTP：配成10mM——dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。）
3）氯仿-异戊醇：配成24：1的比例，室温避光保存。4)酚：氯仿：异戊醇=25：24：15)3MNaAc、ddH2O6)无水乙醇：70%乙醇7)TE缓冲液（三）实验步骤
1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：（混匀）
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议