依赖解旋酶DNA等温扩增技术的研究进展作者:贾辉 胡兰 马晓威来源:《新农业》2015年第05期 摘 要:依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA)是近年来发明的一种新型的模拟动物体内DNA复制的等温扩增技术,HDA具有简便、高效、快速的优点,不需复杂的科学仪器,反应在常温下进行,适用于基层实验室,具有广阔的应用前景。
关键词:依赖解旋酶DNA金属表面喷涂等温扩增技术;DNA解旋酶;单链DNA结合蛋白
依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA),是美国NEB公司在1 632004年发明的核酸等温扩增技术。依赖解旋酶DNA等温扩增技术是模拟动物体内DNA复制的过程,不需要在昂贵的PCR仪上进行反应,仅在恒温水浴锅上使用即可完成反应。条码检测
1 HDA 的原理
HDA的原理极其简单,首先用解旋酶解开双链DNA,然后依靠单链DNA结合蛋白(SSB)与模板单链相结合,使模板单链始终处于单链状态,同时保护它的完整性,然后模
gcr15热处理工艺板与引物进行杂交,在DNA聚合酶的催化下进行扩增,新合成的双链DNA作为模板继续扩增。
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2 HDA检测方法的建立要点
2.1 模板的选择
一般情况下,解旋酶的解旋能力决定着可扩增序列长度。HDA选用的是大肠杆菌解旋酶Ⅱ(UvrD)解旋酶,UvrD的解链速度是20bp/秒,连续性是100bp,因此进行扩增的模板长度为70~120bp。
2.2 酶的选择
目前常用的解旋酶是大肠杆菌解旋酶Ⅱ(UvrD),UvrD在核酸的核苷酸的切除修复和错配修复中起到了重要的解旋作用,UvrD是由720个氨基酸组成的,是SF1解旋酶家族一员。还有一种新发现的解旋酶—T7噬菌体基因4编码蛋白,解链速度是300bp/秒,扩增质粒DNA的长度是2.5kb,它的解链速度比UvrD更快,扩增长度更长。目前常用的SSB包括T4噬菌体基因32编码蛋白和RB49噬菌体基因32编码蛋白;常用的DNA聚合酶是Bst DNA
聚合酶或者是Klenow Fragment(3′-5′exo-FANPN)聚合酶。