环境中微生物检测方法

环境中微生物的检测

微生物体积小、重量轻，因此可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步。微生物种类繁多，对外界环境的适应能力又很强，只要生活条件合适，它们就可以迅速繁殖起来。因此，它们是自然界分布最广的一生物。无论是南极、北极、高山、海洋、陆地、淡水，还是土壤、空气、动植物体内外，几乎到处都有它们的踪迹。

空气、水是维持人类生命不可或缺的物质。它们直接进入人体或与人接触。如果带有病原微生物，将成为传染疾病的媒介。通过空气和水中微生物的检验，对环境质量进行控制。

1.1 土壤中的微生物

1.1.1 土壤是微生物生活的良好环境

在自然界，土壤是微生物生活的良好环境。因为土壤具有微生物生长繁殖所必需的各种环境条件。

1.1.1.1 营养

土壤中有大量动植物残体、植物根系的分泌物、人和动物的排泄物，这些有机物为微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中丰富的矿质元素可以满足微生物对矿质营养的要求。

1.1.1.2 水分和渗透压

土壤中具有一定的持水性，可为微生物提供水分；土壤的渗透压对微生物是等渗或低渗环境，有利于微生物摄取营养。

1.1.1.3 空气

土壤团粒结构中的小孔隙充满空气，土壤中氧的含量比大气少，平均为土壤空气体积的7%-8%。通气良好的土壤，氧的含量高些，有利于好氧微生物的生长。

1.1.1.4 pHstkx值

土壤的pH多接近中性，且缓冲能力强，适合大多数微生物生长的需要。在酸性或碱性的土壤中，亦有与之适应的微生物生长繁殖。

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1.1.1.5 温度

土壤还具有保温性，与空气相比，昼夜温差和季节温差要小得多。即使冬季地面冻结，一定深度的土壤中仍保持一定的温度。一般是10～25℃，适宜多种微生物生长的需要。

此外，土壤表面几毫米厚的表层土是保护层，使土壤中的微生物可以免遭太阳光中紫外辐射直射致死。以上这些都为微生物生长繁殖提供了良好的条件。所以土壤有“微生物天然培养基”的美称。在土壤中的微生物种类最多，数量最大，是人类利用微生物资源的主要来源。

1.1.2 土壤微生物的种类、数量及其分布

土壤中微生物的种类和数量都很多。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。如有机物含量丰富的黑土、草甸土等肥沃土壤，微生物含量较高，每克土可含几亿至几十亿个微生物；而红壤、棕钙土、盐土等贫瘠土壤，微生物的含量很少，每克土也含几百万至几千万个微生物。

1.1.2.1 微生物种类和数量

土壤这中的微生物有细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等类。其中细菌数量最多，放线菌和真菌次之，藻类和原生动物等的数量较少。

（1）细菌

约占土壤微生物总数的70%~90%，含量达每克土几百万个至几亿个，主要是异养型种类，少数为自养型。异养型种类积极参与土壤有机质的分解和腐殖质的合成。自养型种类转化着矿质养分的存在状态。

纸浆模具土壤中常见的细菌有固氮细菌、氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸还原细菌、纤维素分解菌、假单胞菌、黄杆菌、钾细菌和铁细菌等。

（2）放线菌

约占土壤微生物总数的5%~30%，含量为每克土几千万至几亿个孢子。在偏碱性土壤中数量较多，都是异养型种类。放线菌较耐干旱，在潮湿土壤中比干旱土壤中少，在渍水条件下，如土壤持水量在80~100%时，放线菌很少出现。土壤中常见种类有诺卡氏菌属、链霉菌属和小单孢菌属。

（3）真菌

每克土壤中有真菌几千至几十万个，均为严格好氧的异养型种类。酵母菌的含量较少，一般为每克土壤几个到几千个。但在葡萄园和果园的土壤中，每克土壤酵母菌含量可达几十万个。真菌中的霉菌，以丝状体的菌丝交织曼延在土壤中起改良土壤团粒结构的作用。土壤中最常见的霉菌有青霉、曲霉、枝孢霉、头孢霉等。微型超级电容器

（4）藻类

土壤中藻类的数量不多，不到微生物总数的1%，但分布却很普遍。一般生长在土壤表层，多为单细胞绿藻和硅藻。藻类为光合型微生物，受阳光及水分影响较大，土壤下层因无阳光，数量少。在温暖季节中，积水的土面上藻类大量发育，其中主要有衣藻、小球藻、丝藻及各种硅藻，水田内则发育有水绵等丝状绿藻，为土壤积累有机质。

（5）原生动物

在不同类型的土壤中数量变化很大，每克土壤有几十个至几十万个，在富含有机质的土壤中主要有纤毛虫、鞭毛虫、肉足虫等，大多数种类是异养型的，以吞食各种有机物的碎片

、藻类、菌类等为生。

土壤中的微生物是土壤的组成成分，通过它们的代谢活动，转化土壤中各种物质的状态，改变土壤的理化性质，是构成土壤肥力的重要因素。

1.1.2.2 微生物在土壤中的分布状况

（1）水平分布

土壤中微生物的水平分布取决于碳源，例如油田地区存在分解石油的微生物；林区存在大量分解纤维素的微生物；在动植物残体较多的土壤中则有较多的氨化细菌和硝化细菌。

（2）垂直分布

土壤中微生物的垂直分布与紫外线的照射、营养、水、温度、通气等环境因子有关。

表层土因受紫外线照射和缺乏水，微生物不易生存，在5～20cm的土层中处微生物数最多，随土层的加深，菌数减少，这是由于缺乏营养和氧气造成的。

1.1.3 土壤微生物的分离和计数

多采用稀释平皿法，操作步骤如下：

1.1.3.1 取样

选定取样区域，去表层土，按对角交叉取样法取五点土样混匀。称取10g混匀土样两份，一份用于制备土壤稀释液，另一份土样烘干至恒重（105℃，8h），置于干燥器中冷却后称重。

1.1.3.2 制备土壤稀释液

在含90mL无菌稀释水和玻璃珠的锥形瓶中加入土样10g，振荡10min，制成土壤悬浮液，将土壤悬浮液作10倍递减稀释至适当浓度。细菌采用10－4～10－1、放线菌采用10－3～10－5、霉菌采用10－2～10－4为适宜浓度。

1.1.3.3 混菌法接种

取适当浓度的稀释菌悬液1mL加入无菌平皿，然后倒入合适的培养基，趁热将菌液和培养基混匀。每个稀释度须做平行。

如只进行分离而不计数，对土壤悬浮液可不作系列稀释，采用划线分离法或涂布分离法即可。

1.1.3.4 培养

待培养基冷却后，倒置于培养箱中，在适宜的温度下培养相应的时间（细菌在37℃下培养1d～2d、放线菌和真菌则在28℃下培养5d～7d）。

1.1.3.5 计数

计数平皿上出现的菌落。细菌和放线菌选取菌落数为30～300的平皿、真菌选取菌落数为10～100的平皿进行计数。

如需获取纯种，可取单个菌落进行试管斜面转接，培养后，选用适宜方法保存。

1.1.3.6 计算每克干土含菌数

每克干土含菌数＝每克湿土含菌数×湿土重/干土重

土壤中微生物的数量是土壤自净作用的基础，也是土壤生物修复的主力军。由于土壤有团粒结构，又栖息着数量庞大、种类繁多的微生物及其他生物，使土壤具有很强的吸附、过滤和生物降解能力。当污水和污物进入土壤后，先被土壤吸附，紧接着又被微生物及其他生物降解，使土壤逐渐恢复到原来的状态。

1.2水体中的微生物

水体可分为天然水体和人工水体。天然水体包括海洋、江河、湖泊等；人工水体包括水库、运河、城市排水系统、各种污水处理系统等。水体中含有微生物所需的各种营养，因而也是微生物的天然生境。水体中微生物除天然栖息者外，还有来自土壤、空气、动植物残体、动物排泄物、各类工业废水和生活污水中的微生物，其中包括某些病原微生物。

1.2.1水中微生物的种类、分布

由于各水域中营养物质的组成、浓度、水温、溶解氧的差异及微生物的来源不同，因此其种类、数量差异很大。

1.2.1.1 微生物的种类

（1）清水型水生微生物

在洁净的水域中，因营养物较少，微生物数量也较少。在每毫升水中一般只含几十个到几百个细菌，并以自养型种类为主。常见的细菌有绿硫细菌、紫细菌、蓝细菌、柄细菌、赫纤毛菌、球衣细菌和萤光假单胞菌等。此外，还有许多藻类（如丝状绿藻、硅藻等）、真菌（水霉菌属和绵霉菌属）、原生动物（如钟虫及其他固着型纤毛虫等）和后生动物（如枝角类、桡足类等）。

（2）腐败型水生微生物

在受到有机物严重污染的水域中，数量较多的是细菌，每毫升水中可达几千万个甚至几亿个，以异养菌为优势。异养菌分解有机物，起重要的净化作用。常见的微生物中，细菌以变形杆菌、产气肠杆菌、产气碱杆菌、等革兰氏阴性无芽孢菌为主，此外还有芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、粪链球菌、弧菌、螺菌、假单胞菌，有的甚至还含有伤寒、痢疾、等病原体；藻类有绿藻、裸藻等；原生动物有草履虫、屋滴虫、小口钟虫等。

1.2.1.2 微生物的分布

影响微生物在水体中分布的因素有：水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、pH及水深等。

微生物在水体中的水平分布规律为：近岸水域中细菌数量较多，离岸越远的地方，微生物越少；底泥中的细菌多于水中的细菌。

微生物在较深较大的静水水域中的垂直分布规律是：在上层水体中（水面下0~10m深处），氧含量较高，主要有好氧细菌（如假单脆菌、柄杆菌、球衣细菌等）、真菌和藻类；中层水体（水深20~30m）主要有光合细菌（如红硫细菌和绿硫细菌）以及厌氧细菌；底层水体中（30m以下及湖底泥），主要有脱硫弧菌属、甲烷杆菌属和甲烷球菌属等厌氧细菌。微生物的数量以5~10m深处为最多，随着深度的增加而减少。

地下水由于经过土壤过滤、有机物缺乏，故含菌量远远少于地面水，在深层地下水中甚至没有细菌。

自动甩干拖把1.2.2 水的细菌学检测

1.2.2.1 细菌总数（CFU）的测定

细菌总数是将定量水样（原水样或作一定稀释后水样1mL）接种在普通营养琼脂培养基内，于37℃培养24h后观察结果，计数其上长出的细菌菌落数，然后换算求出原水样每mL中所含的细菌数。

其测定步骤和土壤中微生物的分离计数方法基本相同，但须注意：①水样是用无菌采样瓶直接采取水样；②水样接种于营养琼脂培养基中，在37℃下培养24h；

在37℃营养琼脂培养基中能生长的细菌，代表在人体温度下能繁殖的异养型细菌。细菌总数越多，说明水被有机物或粪便污染越重，被病原菌污染的可能性也越大。

在生活饮用水中所测得的细菌总数，除说明水被生活废弃物污染的程度外，还可指示该水能否饮用。可在生活饮用水进行卫生学评价时提供依据。

旗杆基础

我国生活饮用水标准（GB5749-85）规定，细菌总数不得超过100个/ml。