一种MOFs纳米酶及在新冠病毒检测中的应用

一种mofs纳米酶及在新冠病毒检测中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药及临床诊断技术领域，特别涉及一种mofs纳米酶及在新冠病毒检测中的应用，具体是利用mofs纳米酶实现sars-cov-2可视化、快速和高灵敏检测的方法。

背景技术：

2.新型冠状病毒2019-ncov/sars-cov-2正处于在世界蔓延的势头，人类却缺乏有效的抗病毒疫苗和特效药物，当前对感染者或携带者准确检测诊断对于疫情控制具有至关重要的作用及意义。目前，covid-19的诊断策略主要基于核酸检测、抗体检测和抗原检测三种方法。核酸检测是新冠肺炎临床诊断的“金标准”，根据核酸扩增检测出低量病毒。逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)结合自动制样系统可以批量检测出鼻咽或唾液中存在的sars-cov-2核酸。但核酸检测结果受到患者病程、标本采集、检测试剂质量等因素的影响，阳性检出率仅为30-50％。因此，提高检测灵敏度和特异性仍然是提高检测灵敏度和效率的迫切需要解决的问题。此外，昂贵和不灵活的检测设备也限制了它在大规模多样品的应用。抗体检测主要是检测血清中的新冠病毒特异性igm和igg抗体，是一个补充和快速的病毒检测方法，但这种方法通常适用于他们只能诊断那些感染后至少10-14天，这可能会导致假阴性结果。为了应对这些问题，近年来，各种基于特定病毒蛋白(包括抗原)的检测方法因其高灵敏度、高选择性和快速测量而被提出用于鉴定存在的病原体，可以降低交叉反应的几率，有效提高其特异性。在这些方法中，比法由于其简单、经济、特别容易用肉眼读出，是一种有吸引力的病毒检测方法，这种试验有很大的潜力在偏远地点进行操作，不需要复杂的设备就可以使用。
3.酶催化能够催化显分子变，是最常用比法之一，然而，酶在恶劣的条件下很容易失活，限制了它的应用。近年来，金属有机框架结构(metal-organic frameworks,mofs)因其具有类过氧化物酶特性一样的功能，能够分解h2o2产生
·
oh，氧化显剂显，被广泛应用于比生物传感器的构建。

技术实现要素：

4.为了克服上述现有新冠检测方法的不足，本发明的目的在于提供一种mofs纳米酶及在新冠病毒检测中的应用，是一种基于mofs纳米酶的简单、快速、高灵敏无标记，可视化检测sars-cov-2的新方法，该方法通过mofs纳米酶特有的过氧化物酶特性，无语额外的标记过程，通过简单的比法，实现sars-cov-2的无标记、快速、高灵敏、可视化的检测。
5.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种mofs纳米酶，由对苯二甲酸作为配体，与金属离子通过鳌和作用形成金属的mofs材料，金属的mofs材料表面有羧基，与带有氨基的cd147分子发生缩合，使得cd147分子固定在mofs表面，金属离子选自fe，cu，ni，pt中的一种或多种。
7.基于上述一种mofs纳米酶在新冠病毒检测中的应用，利用mofs的类酶特性和表面
修饰cd147蛋白对新冠病毒的特异结合能力，能够催化显分子tmb、abts、opd和ppd的分子显能力，实现sars-cov-2比定量和定性检测。
8.所述的mofs纳米酶具有类过氧化物酶特性，能催化过氧化氢产生羟基自由基，氧化显分子tmb、abts、opd和ppd，通过比法实现对新冠病毒检测。
9.tmb即3,3
′
,5,5
′‑
tetramethylbenzidine、
10.abt即2,2
′‑
azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)、
11.opd即o-phenylenediamine、
12.ppd即p-phenylenediamine。
13.所述的mofs纳米酶，其表面修饰有特异性蛋白cd147，利用cd147与新冠病毒sars-cov-2表面过表达的s蛋白的特异结合，将新冠病毒结合在纳米酶表面从而抑制纳米酶的催化显，实现新冠病毒sars-cov-2定量定性分析。
14.所述的mofs纳米酶修饰cd147后，mofs催化活性下降，氧化tmb、abts、opd和ppd分子变的能力下降。
15.所述修饰cd147，是mofs纳米酶表面的羧基与cd147的氨基缩合连接。
16.所述的cd147与sars-cov-2特异性结合，mofs纳米酶催化活性降低，氧化tmb、abts、opd和ppd分子变的能力进一步变弱。
17.与现有生物分子识别检测技术相比，本发明的优点是：
18.1、mofs纳米酶制备过程简单，成本低。
19.2、mofs表面具有大量的羧基官能团，实现cd147分子的化学固定。
20.3、mofs纳米酶具有高的类过氧化物酶特性，能催化h2o2生成
·
oh，氧化显分子tmb、abts、opd和ppd变，识别sars-cov-2后，mofs催化能力下降，氧化tmb、abts、opd和ppd变能力减弱，整个显过程2分钟内完成。利用这一独特的显特性，实现sars-cov-2的快速、可视化、高灵敏检测；
21.4、本发明是一种结合酶催化显的无标记、可视化检测sars-cov-2新方法。
附图说明
22.图1为本发明的检测方法用于检测sars-cov-2的原理示意图。
23.图2为实施例1制得的mofs的电镜图片以及金属离子与对苯二甲酸连接的示意图,其中(a)电镜图片；(b)为金属离子与对苯二甲酸连接的示意图。
24.图3为实施例1中cd147分子固定在mofs的红外和拉曼光谱图，其中(a)为修饰cd147后的红外图，(b)为修饰cd147后的拉曼光谱图。
25.图4为实施例1中在ph 3.5条件下mofs纳米酶催化tmb氧化的紫外光谱图，其中曲线a-c为tmb；h2o2/tmb；c:mofs/h2o2/tmb
26.图5为实施例1中mofs纳米酶表面修饰cd147和sars-cov-2s-rbd蛋白后催化tmb氧化的紫外光谱图，其中(a)为修饰不同物质前后氧化tmb的紫外可见吸收光谱图，(b)为修饰不同物质后，652nm处氧化tmb的吸光度。
27.图6为实施例1中不同sars-cov-2s-rbd蛋白浓度修饰后mofs纳米酶催化tmb氧化的紫外光谱图。
28.图7为实施例1中在652nm处，不同sars-cov-2s-rbd浓度对数值(ln c)-吸光度关
系图以及tmb溶液颜变化图。
29.图8为实施例1中在652nm处，不同sars-cov-2假病毒浓度对数值(ln c)-吸光度关系图。
30.图9为不同病毒蛋白的tmb氧化的紫外光谱图。
31.图10为实施例1中在652nm处，不同sars-cov-2病毒浓度对数值(ln c)-吸光度关系图。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
33.如图1所示，本发明公开了一种mofs纳米酶及在新冠病毒检测中的应用，是一种实现sars-cov-2高灵敏、可视化检测的新方法，基于mofs纳米酶特有的类酶特性，在适宜条件下(ph3-7)，能催化tmb、abts、opd和ppd分子显；mofs纳米酶表面富有羧基官能团，易于修饰，在纳米酶表面修饰有特异性蛋白cd147后，利用cd147与新冠病毒表面过表达的s蛋白的特异结合，可以高效将新冠病毒结合在纳米酶表面从而抑制纳米酶的催化显。利用这一显原理，实现新冠病毒(sars-cov-2)定量定性分析。
34.所述的mofs纳米酶是fe，cu，ni，pt一种或多种金属的mofs材料，采用微波辅助溶剂热法制备。所述的mofs表面存在大量的羧基官能团，可以修饰有特异性蛋白cd147，构筑功能化纳米酶体系，利用cd147与新冠病毒表面过表达的s蛋白的特异结合，可以高效将新冠病毒结合在纳米酶表面从而抑制纳米酶的催化显，从而用于sars-cov-2的高灵敏、快速、可视化检测。
35.所述的mofs纳米酶由对苯二甲酸作为配体，可以和金属离子fe，cu，ni，pt通过鳌和作用相连，金属离子比例通过控制投料的金属盐比例控制，形成不同金属比例的mofs纳米酶。mofs纳米酶尺寸，形貌可以通过反应投料比，反应时间，反应温度控制得到。本发明采用fecu mofs纳米酶，金属离子与对苯二甲酸连接结构如图2中的(b)。
36.所述的cd147分子通过化学方法固定mofs表面。具体地，例如在mofs表面有羧基，在生物交联剂1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(edc)和n-hydroxysuccinimide(nhs)作用下，带有氨基的cd147分子与mofs的羧基发生缩合。
37.如图1所示，本发明采用tmb显分子，mofs纳米酶特有的类酶特性，在适宜条件下，能催化tmb分子显变蓝，氧化tmb在652nm处有最大的紫外可见吸收，特异性蛋白分子cd147是通过mofs表面的羧基与其表面的氨基结合固定在mofs表面，新冠病毒表面过表达的s蛋白与cd147特异结合，可以高效将新冠病毒结合在纳米酶表面从而抑制纳米酶的催化显。利用这一原理，实现对sars-cov-2分子进行比定量和定性检测。
38.实施例1
39.(1)mofs纳米酶的制备。
40.采用微波辅助溶剂热的方法，制备多金属mofs，mofs的形貌通过反应温度，投料比和反应时间调控。最后通过化学固定使cd147分子固定在mofs表面。具体方法为：
41.(1-1)采用微波辅助溶剂热法，将对苯二甲酸与金属离子fe，cu鳌和连接制备双金属fecu mofs，mofs的形貌、尺寸和比例可以通过反应中配体与金属离子比例(1-10):(1-10)，不同金属离子比例(1-50):(1-50)，以及反应温度120-160℃和反应时间2-12h控制；
42.(1-2)对步骤(1-1)所得产物用乙醇清洗，烘干；
43.(1-3)将经过步骤(1-2)得到的mofs，加入cd147溶液，所述的cd147，其溶液的溶剂为pbs溶剂，其中cd147的浓度为7-200μg/ml,所述cd147溶液需先和edc反应10-30分钟，体积比为8:(1-2)，然后加入与edc相同体积的nhs，所述edc的浓度为0.8-1.0mg/ml，所述的nhs的浓度为0.7-0.9mg/ml，在4℃下8-24h化学缩合。
44.图2中的(a)是制备的mofs的扫描电镜的表征，可以看出，尺寸大约为200-300nm左右。由上述(1-3)可知，cd147与mofs通过-nh2和-cooh酰胺化相连，图3对-nh2和-cooh酯化形成的酰胺键进一步红外表征以及拉曼光谱表征。由上述表征可以得出，cd147成功固定在mofs上。
45.(2)mofs纳米酶催化体系。如图4所示，mofs纳米酶类酶的催化特性，能催化显分子tmb显变蓝，测定氧化tmb的紫外光谱在652nm处有最大吸收。
46.(3)mofs纳米酶体系检测sars-cov-2s-rbd。如图5所示，cd147探针修饰后，抑制了mofs类酶的催化特性，催化显分子tmb显变蓝能力下降，不同浓度的sars-cov-2s-rbd溶液分别与cd147修饰的mofs结合后，由于蛋白分子覆盖了mofs表面的催化活性位点，mofs纳米酶催化氧化tmb能力进一步下降，得到不同条件下的紫外可见吸收光谱关系曲线，如图6所示。提取不同浓度对应的652nm处的吸光度值，构建sars-cov-2s-rbd与之相对应浓度梯度的标准曲线，如图7所示。由图可知，本发明的检测可以实现sars-cov-2s-rbd的可视化、快速、高灵敏的检测，检测限低至6.2
×
10-13
g/ml。
47.mofs纳米酶体系检测sars-cov-2假病毒
48.方法同步骤3，其中步骤3中的sars-cov-2s-rbd溶液换为sars-cov-2假病毒。在其它条件不变情况下，同样得到紫外光谱曲线，如图8所示，提取不同浓度对应的652nm处的吸光度值，构建sars-cov-2假病毒与之相对应浓度梯度的标准曲线。
49.选择性实验
50.方法同步骤3，其中sars-cov-2s-rbd换成不同的病毒蛋白，在其它条件不变情况下，进行比分析。图9是不同病毒蛋白的652nm处吸光度改变值，可以看出，本发明提出的纳米酶体系对sars-cov-2s-rbd有高的选择性。
51.实际样品sars-cov-2检测
52.方法同步骤3，其中步骤3中的sars-cov-2s-rbd溶液换为实际sars-cov-2溶液，在其它条件不变情况下，同样得到紫外光谱曲线，如图10所示，提取不同浓度对应的652nm处的吸光度值，构建sars-cov-2与之相对应浓度梯度的标准曲线。由图可知，本发明的检测可以实现sars-cov-2的可视化、快速、高灵敏的检测，检测限低至3pfu/ml。

技术特征：

1.一种mofs纳米酶，其特征在于，由对苯二甲酸作为配体，与金属离子通过鳌和作用形成金属的mofs材料，金属的mofs材料表面有羧基，再与带有氨基的cd147分子发生缩合，使得cd147分子固定在mofs表面，金属离子选自fe，cu，ni，pt中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的一种mofs纳米酶在新冠病毒检测中的应用，其特征在于，利用mofs的类酶特性和表面修饰cd147蛋白对新冠病毒的特异结合能力，能够催化显分子tmb、abts、opd和ppd的分子显能力，实现sars-cov-2比定量和定性检测。3.根据权利要求2所述的一种mofs纳米酶在新冠病毒检测中的应用，其特征在于，所述的mofs纳米酶具有类过氧化物酶特性，能催化过氧化氢产生羟基自由基，氧化显分子tmb、abts、opd和ppd，通过比法实现对新冠病毒检测；tmb即3,3
′
,5,5
′‑
tetramethylbenzidine；abt即2,2
′‑
azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)；opd即o-phenylenediamine；ppd即p-phenylenediamine。4.根据权利要求2所述的一种mofs纳米酶在新冠病毒检测中的应用，其特征在于，所述的mofs纳米酶，其表面修饰有特异性蛋白cd147，利用cd147与新冠病毒sars-cov-2表面过表达的s蛋白的特异结合，将新冠病毒结合在纳米酶表面从而抑制纳米酶的催化显，实现新冠病毒sars-cov-2定量定性分析。5.根据权利要求2所述的一种mofs纳米酶在新冠病毒检测中的应用，其特征在于，所述的mofs纳米酶修饰cd147后，mofs催化活性下降，氧化tmb、abts、opd和ppd分子变的能力下降；所述修饰cd147，是mofs纳米酶表面的羧基与cd147的氨基缩合连接。6.根据权利要求2所述的一种mofs纳米酶在新冠病毒检测中的应用，其特征在于，所述的cd147与sars-cov-2特异性结合，mofs纳米酶催化活性降低，氧化tmb、abts、opd和ppd分子变的能力进一步变弱。

技术总结

一种MOFs纳米酶及在新冠病毒检测中的应用，涉及生物检测方法领域，MOFs基纳米酶具有类过氧化物酶作用，能催化显剂变；在纳米酶表面修饰有特异性蛋白CD147后，利用CD147与新冠病毒表面过表达的S蛋白的特异结合，可以高效将新冠病毒结合在纳米酶表面从而抑制纳米酶的催化显；基于该原理，可实现比法对新冠病毒的定量和定性检测；本发明通过纳米酶固有的催化优势和CD147对新冠病毒的特异识别和结合能力，无需额外的标记过程，实现新冠病毒的快速、高灵敏和可视化的检测，能够有效鉴别新冠病毒感染。别新冠病毒感染。别新冠病毒感染。