一、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量( 1g 样品加入 3.5ml 提取液,可根据材料不同适当加入),准备提 取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置( 3-4 小时)。
3、 用离心机离心 8000rpm40min4 C或 11100rpm20min4 °C
滚动鼠标
4、 提取上清液,样品制备完成。
蛋白质提取液: 300ml
1 、 1Mtris-HCl ( PH8) 45ml
2、 甘油( Glycerol ) 75ml
3、 聚乙烯吡咯烷酮( Polyvinylpolypyrrordone ) 6g
这种方法针对 SDS-PAGE垂直板电泳!
二、植物组织蛋白质提取方法
1 、在液氮中研磨叶片
2、 加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜,然后离心(4 C 8000rpm以上1 小时)弃上清。
3、 加入等体积的冰浴丙酮(含 0.07%的3 -立方体拼图巯基乙醇),摇匀后离心(4C 8000rpm 以上 1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。
4、 上样前加入裂解液, 室温放置 30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中, 然后离心 (15C
8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在 4 C待用。
5、 用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入 -80 C备用。
药品:提取液:含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮。裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为 5ml),使用前再加入 1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只 是电泳的条带会减少!
三、组织:肠黏膜
目的:WESTERN BLO检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤:
含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每ImITRIPURE用量)
倒转混匀,置室温 10min
离心: 12000 g,10min,4 度,弃上清
加入0.3M盐酸胍/95 %乙醇:(2ml每ImITRIPURE用量)
振荡,置室温 20min
离心: 7500g ,5 min , 4 度,弃上清
重复 0.3M 盐酸胍 /95 %乙醇步 2 次
沉淀中加入 100%乙醇 2ml
充分振荡混匀,置室温 20 min
离心: 7500g ,5min,4 度,弃上清吹干沉淀
1 % SDS溶解沉淀
离心: 10000g,10min , 4 度
取上清 -20 度保存(或可直接用于 WESTERN BLO)T
存在的问题:加入 1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块, 4度离心后又多了白
沉定,SDS结晶?测浓度,含量才 1mg/ml左右。
解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加 2X BUFFER然后煮5- 10
分钟,效果很好的。
四、植物材料:水稻苗,叶鞘,根
1 、 200 毫克样品置于冰上磨碎
2、加 lysis buffer ,离心, 10000rpm,4 度, 5min 取上清
3、重复离心 5min
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按 Davermal 等( 1986)的方法进行。
100mg材料剪碎后加入1OmgPVP-4O(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成 粉,加入1.5 ml 10% 三(丙酮配制,含10mM即卩0.07% B -巯基乙醇),混匀,-20 C 沉淀1小时,4C, 15000 r/min 离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(
含10 mM3 - 巯基乙醇)遥控直升机制作,再于-20 C沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mM3 - 巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20卩1(可调)UKS液[9.5 M 尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS 0.5%DTT(二 硫苏糖醇 ), 2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc , pH3.5-10) , 6% Triton X-100] , 37C温育30min,期间搅动几次,28度(温度低,高浓度的尿素会
让溶液结冰)16000 r/min 离心15 min,离心力越大时间长一点越好! 上清即可上样电泳。
或者 -70 度保存。
六、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 装 1.5 ml centrifuge 用 tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4 度, 10-15minite
(5) 取上层液,蛋白质就在里面
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、 加入样品体积3倍的提取液在制卡机-20 C的条件下过夜,然后离心(4 C 8000rpm以上1小时) 弃上清。
3、 加入等体积的冰浴丙酮(含 0.07%的3 -巯基乙醇),摇匀后离心(4 C 8000rpm以上1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。
4、 上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中, 然后离心(15 C 8000rpm
以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在 4C待用。
5、 用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入 -80 C备用。
药品:
提取液:含10%TCA和0.07%的 3 -巯基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入 1M 的 DTT65ul/ml 。
这种方法针对双向电泳, 杂质少, 离子浓度小的特点! 当然单向电泳也同样适用, 只是电泳 的条带会减少!
植物组织蛋白质提取方法 (一)
1、根据样品重量( 1g 样品加入 3.5ml 提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放 在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置( 3-4 小时)。
3、用离心机离心 8000rpm40mi n4C或 11100rpm20mi n4C
蛋白质提取液: 300ml
4 、提取上清夜,样品制备完成。
1 、 1Mtris-HCl ( PH8) 45ml
2、 甘油( Glycerol ) 大体积混凝土降温75ml
3、 聚乙烯吡咯烷酮( Polyvinylpolypyrrordone ) 6g 这种方法针对 SDS-PAG,E 垂直板电泳! 植物组织蛋白质提取方法(二)
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、 加入样品体积3倍的提取液在-20C的条件下过夜,然后离心(4C 8000rpm 以上1小时) 弃上清。
3、 加入等体积的冰浴丙酮(含 0.07%的3 -巯基乙醇),摇匀后离心(4C 8000rpm 以上1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。
4、 上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中, 然后离心(15C8000rpm 以上lc-a1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在 4C待用。
5、 用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入 -80C备用。
药品:
提取液:含10%TCA和0.07%的 3 -巯基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入 1M 的 DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳, 杂质少, 离子浓度小的特点! 当然单向电泳也同样适用, 只是电泳 的条带会减少!
TCA-丙酮沉淀法,有人做过落叶松的的花粉
步骤:
1 、液氮研磨充分
2、 加入含 10%TCA、 0.07%的巯基乙醇的丙酮溶液, -20 度沉淀过夜
3、 4 度, 1000rpm 离心 1 个小时,弃上清。