用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法

附件1：用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法

基本原理：

将蛋白样品还原并烷基化后，用胰蛋白酶把蛋白酶解成肽段，然后用液相谱/质谱仪对其进行分析。

试剂、生产厂家以及产品编号：粉底原料

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使用方法：

1. 取约1毫克的总蛋白样品放入离心管中，加入1毫升6M的Guanidine(配制在100mM NH4HCO3中，PH 8.0)溶液，得到1mg/mL的蛋白溶液。

2. 加入20微升1M的DTT到上述离心管中，震荡混合5秒钟。地球仪制作方法简单

3. 将上述离心管恒温在37℃条件下反应1小时(以还原蛋白中的双硫键)。

4. 加入25微升1M新鲜配制在1M NaOH中的Iodoacetic acid，在避光、室温条件下放置30分钟。

5. 将以上样品平均注入两个(每个约注入500mL)具有分离10kDa以下蛋白的Centricon filter，以12000rpm离心50分钟。

6. 移动语音短信在以上离心管中分别加入200mL 0.1M的NH4HCO3，并离心30分钟。多次重复此操作，以使蛋白样品中的Guanidine含量降到0.5M左右。

7. 将以上两个离心管滤层上的蛋白样品，分别、多次加入总量约500mL 0.1M的NH4HCO3溶液以完全溶解，并将这些含有蛋白样品的溶液转移到装有20mL的Trypsin试管中，再加

入500mL 0.1M的NH4HCO3溶液。使试管中液体的总量为1000mL，Trypsin约占总量的1/50。

8. 将上述试管恒温在37℃水浴中反应16小时。

9. 分别吸取上述样品500mL到两个Centricon filter中，以13400rpm离心50分钟。这样可以除去多余的Trypsin，终止酶切反应。(为节省时间，这里的过滤步骤可省略)

10. 将上述两个离心管下部的滤出液收集到一个离心管中，在35℃下真空干燥浓缩60分钟。此过程有助于NH4HCO3的分解并挥发，降低样品中盐的浓度。继续干燥浓缩至样品量到100mL左右。

11. 加0.1%的甲酸溶液定量到所需要的样品浓度，并注意观察样品溶液是否澄清。若样品溶液有浑浊状，需在12,000-14,000rpm条件下离心10分钟，取上清液进样分析。

* 起始蛋白液不可或只含极微量界面活性剂。

本文发布于:2024-09-21 20:34:47，感谢您对本站的认可！

标签：样品蛋白溶液离心管

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